黃芩苷對(duì)人牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及作用機(jī)制

黃瓊 李婧 李長(zhǎng)宏

(1.西寧市口腔醫(yī)院牙周科，青海 西寧 810000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科，青海 西寧 810000)

牙周病是指發(fā)生在牙周組織的疾病，也是導(dǎo)致成年人牙齒脫落的主要原因之一。包括牙齦炎和牙周炎在內(nèi)的牙周疾病影響全世界多達(dá)90%的人[1]。牙周膜內(nèi)的多能干細(xì)胞即牙周膜干細(xì)胞(Periodontal Ligament Stem Cells,PDLSCs)已被認(rèn)為是牙周組織修復(fù)和再生的理想細(xì)胞來(lái)源[2]。PDLSCs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下顯示出成骨、成脂和成軟骨的特性。此外，PDLSCs移植療法在動(dòng)物模型受損的牙周組織中具有促進(jìn)新骨，新牙骨質(zhì)和功能性牙周膜形成的潛力[3-4]。盡管有這種潛力，但受損的牙周組織中所含的干細(xì)胞相對(duì)較少，要獲得足夠數(shù)量的干細(xì)胞用于移植，就需要有效的分離和體外擴(kuò)增。并且，干細(xì)胞必須遷移到缺損區(qū)域并分化為適當(dāng)?shù)墓δ鼙硇停詤⑴c傷口愈合、組織修復(fù)和再生[5]。因此，有效促進(jìn)PDLSCs的增殖和成骨作用對(duì)牙周組織、牙齦和牙槽骨的再生和重塑具有至關(guān)重要的作用。黃芩苷是一種黃酮類化合物，是從傳統(tǒng)中藥黃芩的根中分離的有效活性成分，具有廣泛的藥理學(xué)功能，如抑菌、抗炎、抗腫瘤和抗變態(tài)反應(yīng)等[6-7]。以往研究顯示，黃芩苷能夠通過(guò)抑制人牙周膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗牙周炎的作用[8]。然而，其對(duì)PDLSCs是否存在影響及可能的機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探究黃芩苷對(duì)PDLSCs生物學(xué)特性的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心ATCC;黃芩苷購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；青-鏈霉素雙抗、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；Wnt/β-catenin信號(hào)通路特異性抑制劑XAV939購(gòu)于美國(guó)Prospec公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)法(CCK-8)檢測(cè)試劑購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)BD公司；引物購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；β-catenin、Cyclin D1和c-myc單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司；HRP標(biāo)記的IgG二抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；蛋白免疫印跡(Western blot)相關(guān)檢測(cè)試劑購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所。本研究經(jīng)西寧市口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、同意。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將凍存的PDLSCs從液氮中取出，融化復(fù)蘇后接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，內(nèi)含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放置在37 ℃培養(yǎng)箱，設(shè)置條件為5% CO2、飽和濕度，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，及時(shí)更換培養(yǎng)液并進(jìn)行傳代，取第3代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PDLSCs種植在96孔板中，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：control組、baicalin組和baicalin+XAV939組。control組PDLSCs以正常DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，baicalin組PDLSCs以濃度為1.0 μmol/L baicalin(根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選黃芩苷的作用濃度)的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，baicalin+XAV939組PDLSCs以濃度為1.0 μmol/L baicalin和4 μmol/L Wnt/β-catenin信號(hào)通路特異性抑制劑XAV939的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 CCK-8檢測(cè) 對(duì)數(shù)期的PDLSCs接種到96孔板中，接種密度為2×104個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后以1.2分組處理，分別在24、48和72 h時(shí)在各孔中加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)4 h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)每孔細(xì)胞的吸光度(OD)值，以O(shè)D值的高低反映PDLSCs增殖能力的大小。

1.4 黏附實(shí)驗(yàn) 在6孔板中加入PBS稀釋的Fibronectin,于4 ℃靜置16 h,吸去Fibronectin,以PBS洗滌3次，再加入0.2%的BSA封閉，室溫靜置2 h,以DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，備用。分組處理48 h的PDLSCs以胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)后稀釋呈1×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取100 μL均勻接種到6孔板中，加入相應(yīng)處理的培養(yǎng)液，放置在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,取出后以PBS洗去未黏附的細(xì)胞，固定，計(jì)數(shù)各組PDLSCs黏附細(xì)胞數(shù)。

1.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) PDLSCs以1.2分組處理48 h,胰酶消化細(xì)胞，以不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將Transwell小室放入24孔板，上室均勻接種約1×104個(gè)細(xì)胞/孔，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放置在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取出小室，用棉簽除去上室殘余細(xì)胞，固定后以1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下(隨機(jī)選取5個(gè)視野)觀察并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.6 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)活性 PDLSCs以1×104個(gè)/mL接種到96孔板中，生長(zhǎng)匯合達(dá)60%時(shí)以1.2分組處理，分別在24、48和72 h按照ALP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定ALP活性。

1.7 RT-PCR檢測(cè) PDLSCs以1.2分組處理48 h,分別收集各組細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒抽提總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA,嚴(yán)格參照RT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行配液和擴(kuò)增。配制20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min;隨后94 ℃變性30 s、60℃退火30 s、72 ℃延伸20 s,循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算各組PDLSC中骨鈣蛋白(OCN)、成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)和骨橋蛋白(OPN)基因的相對(duì)表達(dá)量。使用的引物如下：OCN 上游引物：5′-TCACACTCC TCGCCCTATT-3′，下游引物：5′-GATGAGGTCAG CCAACTCG-3′；RUNX2上游引物：5′-GCAGTTCCC AAGCATTTCAT-3′，下游引物：5′-CACTCTGGCT TTGGGAAGAG-3′；OPN上游引物：5′-ATGATGGC CGAGGTGATAGT-3′，下游引物：5′-ACCATTCAA CTCCTCGCTTT-3′；GAPDH上游引物：5′-GCACC GTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGA AGCACGCCAGTGGA-3′。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集各組處理48 h的PDLSCs,加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min,提取總蛋白，以BCA法對(duì)蛋白定量，行10%的SDS-PAGE電泳，蛋白分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉，加入相應(yīng)稀釋的一抗(β-catenin、Cyclin D1和c-myc一抗均為1∶500稀釋)，4 ℃過(guò)夜，次日加入1∶3000稀釋的HRP標(biāo)記的IgG二抗，室溫反應(yīng)2 h,滴加ECL進(jìn)行顯色，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件計(jì)算各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 三組PDLSCs增殖能力比較 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，baicalin組PDLSCs的OD值從48 h開(kāi)始明顯升高 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組細(xì)胞OD值從48 h開(kāi)始明顯降低 (P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 三組PDLSCs在24、48和72 h時(shí)OD值比較Figure 1 Comparison of OD values of three groups of PDLSCs at 24,48 and 72 h注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.2 三組PDLSCs黏附能力比較 與control組相比，baicalin組PDLSCs貼壁數(shù)明顯增加 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組貼壁細(xì)胞數(shù)明顯降低 (P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 三組PDLSCs黏附能力比較Figure 2 Comparison of adhesion ability of three groups of PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.3 三組PDLSCs遷移能力比較 與control組相比，baicalin組PDLSCs遷移細(xì)胞數(shù)明顯增加 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少 (P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組PDLSCs遷移能力Figure 3 Transwell migration experiment detects the migration ability of three groups of PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.4 各組PDLSCs中ALP活性比較 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組相比，baicalin組ALP活性明顯升高 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組ALP活性明顯降低 (P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 三組PDLSCs中ALP活性比較Figure 4 Comparison of ALP activity in three groups of PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.5 各組PDLSCs中OCN、RUNX2和OPN表達(dá)量比較 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組相比，baicalin組PDLSCs中OCN、RUNX2和OPN相對(duì)表達(dá)量均明顯升高 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組PDLSCs中OCN、RUNX2和OPN相對(duì)表達(dá)量均明顯降低 (P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組PDLSCs中OCN、RUNX2和OPN相對(duì)表達(dá)量比較Figure 5 Comparison of relative expression levels of OCN,RUNX2 and OPN in each group of PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.6 各組PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc表達(dá)水平比較 與control組相比，baicalin組PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc表達(dá)水平均明顯升高 (P<0.05)，與baicalin組相比，baicalin+XAV939組PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc表達(dá)水平均明顯降低 (P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc的表達(dá)水平Figure 6 Western blot detection of β-catenin,Cyclin D1 and c-myc expression levels in PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

3 討論

黃芩苷作為中藥黃芩的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤和抑菌等多種藥理活性[9]。有研究表明，黃芩苷能夠促進(jìn)骨細(xì)胞增殖和分化，在治療骨質(zhì)疏松、骨性關(guān)節(jié)炎等方面發(fā)揮一定的作用[10-11]。李晨睿等[12]研究顯示，黃芩苷能夠通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為其他細(xì)胞系，例如骨骼、脂肪、軟骨和肌肉，從而使基于細(xì)胞療法的組織再生成為可能[13]。PDLSCs這種組織特異性干細(xì)胞系在一定的培養(yǎng)條件下可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，因此PDLSCs是用于牙周組織再生的有前途的方法。

近年來(lái)，研究者在如何提高PDLSCs增殖和分化能力方面做了大量的研究[14]。PDLSCs活性和數(shù)量的增加對(duì)于損傷的牙周組織重建具有十分重要的作用[15]。本研究顯示，黃芩苷能夠促進(jìn)PDLSCs的增殖能力。細(xì)胞遷移在諸如發(fā)育，炎癥和傷口愈合的生物學(xué)過(guò)程中是必不可少的。在修復(fù)和再生過(guò)程中，干細(xì)胞的遷移是關(guān)鍵事件。PDLSCs作為牙周組織中的功能性干細(xì)胞，可以遷移到損傷部位，并分化為成纖維細(xì)胞，成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，并參與牙周再生[16]。本研究結(jié)果顯示，黃芩苷促進(jìn)了PDLSCs黏附和遷移。提示黃芩苷可能通過(guò)促進(jìn)PDLSCs增殖、黏附和遷移抑制牙周病的進(jìn)展。此外，本研究結(jié)果還顯示，黃芩苷上調(diào)了ALP活性，同時(shí)促進(jìn)了人PDLSCs的成骨相關(guān)基因OCN、RUNX2和OPN的表達(dá)。大量研究顯示，ALP活性在一定程度上反映骨活性，也是骨礦化和骨形成的標(biāo)志物之一。當(dāng)具有成骨分化特性的細(xì)胞開(kāi)始向成骨分化時(shí)，ALP活性逐漸升高[17]。事實(shí)證明OCN參與控制礦化過(guò)程，出現(xiàn)在成骨分化的后期。RUNX2是成骨過(guò)程中最重要的轉(zhuǎn)錄因子，并負(fù)責(zé)激活成骨細(xì)胞分化標(biāo)記基因。OPN是一種調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)成骨細(xì)胞的分化、增殖和骨形成至關(guān)重要。OCN、RUNX2和OPN與PDLSCs成骨分化的多個(gè)步驟密切相關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用黃芩苷可能會(huì)誘導(dǎo)PDLSCs的成骨分化，提示黃芩苷在牙周組織形成和重組中能夠發(fā)揮促進(jìn)作用。

既往研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了PDLSCs的增殖和成骨分化[19]。提示該信號(hào)通路可能在黃芩苷誘導(dǎo)的PDLSCs的成骨標(biāo)志物表達(dá)中起作用。在本研究中，黃芩苷干預(yù)的PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc的表達(dá)顯著上調(diào)，表明黃芩苷可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路提高PDLSCs的增殖活性及成骨分化能力。本研究在黃芩苷干預(yù)的PDLSCs中添加Wnt/β-catenin信號(hào)通路特異性抑制劑XAV939,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XAV939能夠部分逆轉(zhuǎn)黃芩苷對(duì)PDLSCs增殖和成骨分化的促進(jìn)作用。證實(shí)了黃芩苷可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控PDLSCs生物學(xué)特性的作用。

4 結(jié)論

黃芩苷可有效促進(jìn)PDLSCs的增殖、黏附和遷移，同時(shí)促進(jìn)成骨分化，該機(jī)制可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)。了解黃芩苷對(duì)PDLSCs生物學(xué)特性的影響和分子調(diào)節(jié)機(jī)制可能有助于闡明黃芩苷在牙周發(fā)育和牙周疾病中的作用，為牙周組織修復(fù)的臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。