零價鐵強化生物硝化效能及機理研究

陳紅，謝靜，成鈺瑩，于鑫，陳善平，薛罡，王美琳，羅意，賀向宇

（1東華大學環(huán)境科學與工程學院，上海 201620；2上海環(huán)境衛(wèi)生工程設計院有限公司，上海 200232）

引 言

隨著科技的發(fā)展，新型藥劑與材料的開發(fā)使用極大提高了人民生活水平，但同時也增加了新型污染物暴露的環(huán)境風險。三氯生（TCS），化學名稱為“5-氯-2-（2，4-二氯苯氧基）苯酚”，由于具有廣譜抗菌性[1]，被作為消毒劑或者防腐劑，廣泛應用于臨床和各類消費品中。但是，TCS也被證明具有生態(tài)毒性，還會影響生物體內酶的活力，甚至可以直接損害DNA造成基因毒性[2]。納米顆粒（NPs）由于具有獨特的物理化學性質，被應用于社會、經濟和工業(yè)各領域，隨著NPs使用量大幅增長，釋放到環(huán)境中的NPs也隨之增加，并且在環(huán)境中不斷積累[3]。在水生介質中，NPs會生成活性氧（ROS），或溶出金屬離子，從而對生物造成毒害影響[3]。

脫氮是污水處理過程中的一項重要環(huán)節(jié)，目前污水處理廠仍普遍采用硝化反硝化生物脫氮工藝。其中，將氨氮氧化為硝氮的硝化作用作為脫氮過程的第一步，對總氮的去除具有重要作用[4]，然而主要負責硝化過程的自養(yǎng)型硝化菌容易受到有毒有害物質的干擾[4]。由于TCS和NPs在人類生產生活的廣泛使用，伴隨使用過程的物質釋放，使其不可避免地進入到污水處理系統(tǒng)中[5-6]，從而影響脫氮處理效果。已有研究發(fā)現(xiàn)，在SBR系統(tǒng)中，1 mg·L-1的TCS能夠抑制硝化作用[7]；1 mg·L-1的CuNPs的長期暴露會大幅降低亞硝化階段的氨氮去除率[6]。此外，由于多種新型污染物可能同時存在于污水管道系統(tǒng)中并且發(fā)生交互作用[8]，其對污水生物處理效能的復合影響有別于單獨影響，研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg·L-1的TCS、10 mg·L-1的CuNPs分別導致硝化效率下降8.7%、34%，而其復合影響使硝化效率下降31.7%[4]。因此，有必要探究如何改善或強化受抑制的生物硝化效果。

零價鐵具有廉價、低毒且不產生二次污染等特點，越來越廣泛地應用于水污染處理中。添加適量的鐵可以增強酶的活性，提高生物處理效率[9]，可通過投加零價鐵提高脫氮除磷效率[10]。此外，鐵的還原作用能夠將多種有毒難降解物質，如偶氮類、硝基苯類、氯代物以及高價金屬陽離子等，轉化為低毒性、易降解的物質[11]，從而減輕對微生物的抑制作用。再者，鐵元素是某些硝化酶（如亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR））的活性中心并且鐵屑釋放出來的Fe3+能夠顯著促進硝化酶(氨單加氧酶（AMO）、NXR)的活性[12]，基于此，鐵屑可以提高好氧階段的硝化效率[12-13]。因此，當生物硝化受到抑制時，通過零價鐵強化具有理論可行性。

另一方面，TCS和銅制劑都具有類似抗生素的作用[1,14]。然而在污水生物處理過程中，若污泥微生物長期暴露在含有TCS、CuNPs的環(huán)境中，可能會導致耐藥細菌的增加和抗性基因的富集。研究發(fā)現(xiàn)零價鐵或亞鐵離子可以增強微生物活性，并且改變微生物群落的組成[10,12,15]，而抗性基因的富集主要與微生物種類有關[16]。因此，鐵的投加可能會改變抗性基因的富集規(guī)律。

本研究以TCS和廣泛使用的納米銅顆粒（CuNPs）作為目標新型污染物，考察投加零價鐵對TCS、CuNPs單獨暴露及復合暴露下受抑制的硝化作用的強化效果，并通過污染物濃度、硝化關鍵酶活力、硝化基因豐度和微生物群落結構探究強化機理。此外，以TCS耐藥性mexB基因，CuNPs抗性基因copA為研究對象，考察零價鐵投加后對抗性基因富集規(guī)律的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與器材

納米銅（CuNPs），分析純，購于阿法埃莎（中國）化學有限公司；三氯生（TCS），分析純，購于Dr.Ehrenstorfer公司。

磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司84-1A；高效液相色譜儀：Thermo公司U3000；電感耦合等離子光譜發(fā)生儀：Agilent公司720ES；冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司LGJ-10E；固相萃取小柱：Supelco公司ENVI-18；氮吹儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司HSC-12A。

1.2 實驗設計

活性污泥來源于上海松江污水廠的二沉池回流污泥，取回的新鮮污泥靜置24 h，排出上清液，濃縮污泥與實驗配水混合，使泥水混合液的MLSS=2500~3000 mg·L-1。配水組成參考文獻[4]，使配水中的COD、NH4+-N和溶解性正磷酸鹽（SOP）的濃度分別為350 mg·L-1、30 mg·L-1和2 mg·L-1，控制配水pH在7.5左右。

實驗設計兩組反應器，反應器設置及運行參數參考文獻[4]，第一組反應器為不添加零價鐵的Sludge組，包含4個反應器，分別是只加入活性污泥和實驗配水的Control組，在空白對照的基礎上添加0.5 mg·L-1TCS的TCS組，另 添 加 了10 mg·L-1CuNPs的CuNPs組，以及同時添加了0.5 mg·L-1TCS和10 mg·L-1CuNPs的TCS+CuNPs組。第二組反應器在第一組的基礎上添加30 g·L-1的零價鐵，其他的反應條件均保持一致，并記為Sludge-Fe組，亦包括4個反應器，分別記為Control+Fe組、TCS+Fe組、CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組。本實驗中使用的零價鐵為鐵刨花。

新鮮污泥經馴化脫氮效率穩(wěn)定在90%以上，再進行后續(xù)污染物暴露及零價鐵強化實驗。

1.3 TCS的測定

泥相中TCS測定需要將污泥先冷凍干燥，研磨過篩，然后稱取0.1 g污泥于20 ml乙酸乙酯中進行超聲萃取，超聲參數為：功率100%，水溫50℃，時間20 min。超聲完畢后，在8000 r·min-1下離心5 min，取上層有機溶液，剩下的混合液繼續(xù)超聲，如此重復3次。收集到的有機溶液經氮吹至5 ml左右，用蒸餾水定容至100 ml，并調節(jié)pH在2~3，經0.22μm的濾膜過濾后，利用高效液相色譜（HPLC）進行測量，色譜條件參考文獻[7]。測量水相中的TCS時，先利用固相萃取裝置對水樣進行富集，水樣以5 ml·min-1的流速緩慢流經小柱，用6 ml的5%的甲醇水溶液（5∶95，體積比）淋洗，真空干燥20 min，最后用3 ml乙酸乙酯洗脫3次。收集洗脫液于玻璃容器中，氮吹近干后，用乙腈定容至1 ml。經0.22μm的濾膜過濾后，利用高效液相色譜（HPLC）進行測量。

1.4 酶活力的測定

取50 ml泥水混合液，在4℃條件下，5000 r·min-1離心5 min后去掉上清液，用磷酸緩沖溶液（0.1 mol·L-1PBS，pH=7.4）清洗污泥，再離心去除上清液，重復清洗3次。將清洗完的污泥重懸于30 ml的磷酸緩沖溶液中，在冰水浴的條件下超聲破碎（20 kHz，5 min），然后在4℃條件下，12000 r·min-1離心15 min，上清液為粗酶提取液。

氨單加氧酶（AMO酶)的測定方法：在0.1 ml的粗酶提取液中，加入1.9 ml含2 mmol·L-1(NH4)2SO4的0.01 mol·L-1PBS，30℃振 蕩30 min，然 后 測 量-N的濃度。

亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR酶）的測定方法：在0.1 ml的粗酶提取液中，加入1.9 ml含1 mmol·L-1NaNO2的0.01 mol·L-1PBS，30℃振蕩30 min，然后測量-N的濃度。測定中需設置空白對照，即用蒸餾水代替粗酶，其他操作相同，然后測量-N的濃度。最后，空白中的-N濃度減去樣品中的-N濃度，即為酶催化過程中消耗的-N濃度。

測定粗酶提取液中的蛋白質濃度，測定方法采用福林-酚試劑法[17]。AMO酶及NXR酶活力的計算公式為，其中，為反應體系中-N的物質的量的變化,μmol,測定AMO酶時為-N的增加量，測定NXR酶為NO-2-N的下降量；t為反應時間，min；mp為反應體系中蛋白質的質量，mg。

1.5 其他指標的測定

2 結果與討論

2.1 鐵促進污泥硝化作用

圖1(a)表示一個反應周期內的氨氮濃度隨時間的變化情況?？瞻捉M的硝化速率在前2 h內最大，然后緩慢降低，最后在6~10 h內氨氮濃度趨于穩(wěn)定，并且最終的硝化效率達到96.4%。相比于空白組，TCS組、CuNPs組以及復合組的硝化作用均受到不同程度的抑制。TCS組、CuNPs組以及復合組在2 h時的硝化效率相近，均在35%左右，且明顯低于空白組的，但是，2~10 h內，CuNPs組的硝化效率明顯高于TCS組和復合組，而后兩組的硝化效率近乎一致。一個周期反應結束后，TCS組、CuNPs組以及復合組的硝化效率分別為75.2%、85.6%和74.9%，明顯低于空白組的96.4%。

有文獻報道，零價鐵能夠促進生物脫氮作用[10-11]，所以在以上4組反應的基礎上引入零價鐵，在TCS、CuNPs單獨作用及復合作用的短期暴露下，研究零價鐵對污泥硝化作用的影響。在圖1(a)中，加鐵組均用虛線表示。在引入零價鐵之后，4組反應器中的硝化效率表現(xiàn)為：Control+Fe組>CuNPs+Fe組>TCS+CuNPs+Fe組>TCS+Fe組，這表明，即便有零價鐵的加入，TCS、CuNPs以及二者的復合還是會抑制污泥的硝化作用，且抑制程度與之前相似。但是，零價鐵的加入會改善污泥的硝化作用，10 h時，Control+Fe組、TCS+Fe組、CuNPs+Fe組 和TCS+CuNPs+Fe組的硝化效率分別為96.9%、78.8%、88.9%和81.6%，與未加入零價鐵時相比，系統(tǒng)中的硝化效率分別提高了0.5%、3.6%、3.3%和6.7%。因此，在TCS、CuNPs短期暴露的條件下，加入零價鐵能夠小幅度地改善污泥的硝化效果，并且對于TCS+CuNPs組的改善程度最高。

圖1 污染物短期暴露時(a)、長期暴露時(b)的氨氮濃度以及長期暴露時硝態(tài)氮濃度(c)隨時間的變化（長期暴露中無鐵投加組的數據引自文獻[4]）Fig.1 The change of ammonia nitrogen concentration with time when short-term exposure(a)and long-term exposure(b)to pollutants and changes of nitrate nitrogen concentration with time under long-term exposure of pollutants(c)(The data in Fig.(b)when long-term exposure without adding iron were quoted from Ref.[4])

短期暴露條件下引入零價鐵，可以輕微改善污泥的硝化效果，然而在污染物的長期暴露下，引入零價鐵會對系統(tǒng)產生怎樣的影響？因此，在連續(xù)運行的反應器中，從第1天起每隔3天取樣，測定反應結束時的出水氨氮濃度，結果如圖1(b)所示。根據成鈺瑩等[4]的研究可知，在TCS、CuNPs的長期暴露過程中，初期會對活性污泥的硝化效果產生不同程度的抑制作用，但隨著時間的推遲，抑制作用會緩慢減弱，同時系統(tǒng)的硝化作用會逐漸恢復至正常。

在投加了零價鐵的4組反應器中，TCS、CuNPs對污泥硝化作用的抑制依然存在，但是，在反應器運行的初期，零價鐵的投加減輕了目標污染物的抑制作用，例如，在第4天，TCS+Fe組、CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組的硝化效率分別達到99.8%、76.8%和85.6%，相比于未投加零價鐵時的95.8%、73.9%和81.1%，三組的硝化效果均有一定程度的改善；此外，污染物長期暴露下，投加零價鐵可在更短時間內恢復硝化效果，如TCS組的硝化效率需在反應第13天時方可達到Control組的硝化效果，而TCS+Fe組在第4天即可恢復硝化效能至空白反應器水平。因此，在污染物長期暴露下，投加零價鐵有利于硝化效率的提高與恢復。

2.2 零價鐵對污染物濃度的影響

經長期運行，系統(tǒng)穩(wěn)定之后，在投加零價鐵和不加零價鐵的兩種情況下，分別測定CuNPs組和復合組中的Cu2+的賦存情況，結果如圖2(a)所示。相比于泥相中的銅離子含量，水相中的含量可以忽略不計，說明進入系統(tǒng)中的銅離子被污泥吸附并在泥相中累積。在不含零價鐵的CuNPs組和TCS+CuNPs組分別測定出115.5 mg·L-1和106.5 mg·L-1的銅離子，當投加零價鐵之后，CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組 的 銅 離 子 含 量 分 別 為80.6 mg·L-1和69.8 mg·L-1，分別減少了34.9 mg·L-1和36.7 mg·L-1的銅離子。這可能是由于零價鐵的強還原性導致CuNPs溶出的銅離子與零價鐵發(fā)生了置換反應[11]：，降低了系統(tǒng)中的銅離子濃度，削減了CuNPs的毒性，同時該反應還可促進零價鐵向亞鐵離子和鐵離子的轉化，有利于改善污泥性能，從而提高污泥的硝化能力。此外，無論是否加入零價鐵，TCS的存在使系統(tǒng)中的銅離子含量略有降低。

圖2 Cu2+(a)、TCS(b)在泥相和水相中濃度Fig.2 Concentrations of Cu2+(a)and TCS(b)in sludge and liquid phases

在研究銅離子賦存情況的同時，也研究了TCS在系統(tǒng)中的含量以及分布情況。經長期運行后，各反應器中泥相和水相中TCS的含量如圖2(b)所示。在長期運行過程中，部分TCS無法被降解，會在系統(tǒng)中積累。在投加零價鐵之后，TCS+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組 中的TCS濃度 分別為147.4μg·L-1和166.4μg·L-1，相比于未投加零價鐵的TCS組（151.2 μg·L-1）和TCS+CuNPs組（189.8μg·L-1），分別減少了3.8μg·L-1和23.4μg·L-1，說明零價鐵的引入可以提高TCS的降解率，削弱毒性，進而改善污泥的硝化作用。系統(tǒng)中TCS在泥相中的含量是107.5~119.2 μg·L-1，在水相中的含量是39.9~72.8μg·L-1，泥相中的TCS含量遠高于水相。與TCS組相比，TCS+CuNPs組中的TCS濃度明顯增多，在泥相和水相中分別增加了5.8%和79.2%，說明CuNPs的存在會降低微生物對TCS的降解能力，促進TCS的富集，并且大幅提高TCS在水相中的含量。與TCS+CuNPs組相比，TCS+CuNPs+Fe組中TCS濃度明顯下降，此外，水相中的TCS濃度下降了34.0%，而泥相中無顯著差別，表明零價鐵能夠在促進TCS降解的同時，削弱CuNPs的影響，明顯降低TCS在水相中的含量。

2.3 反應器中鐵的存在形態(tài)

為了分析污泥中鐵的形態(tài)，從Control組和Control+Fe組的反應器中取出活性污泥進行XPS檢測，結果如圖3(a)、(b)所示。相比于空白組，加入零價鐵的反應器中出現(xiàn)了FePO4的峰(712.8 eV)，此外，F(xiàn)e2O3(710.8 eV)和Fe(OH)O(711.8 eV)的射線強度也顯著增加，這表明零價鐵的引入增加了Fe3+的含量。在反應器內加入鐵刨花會產生生物腐蝕，并且處在曝氣狀態(tài)下，因此會不斷產生Fe3+，并最終沉積于污泥中。

進一步測量Sludge-Fe組四個反應器中Fe3+濃度，結果如圖3(c)所示。由圖可知，Control+Fe組、TCS+Fe組、CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組中Fe3+濃度都很高，分別為207.0、185.6、346.4和297.1 mg·L-1。水相中Fe3+濃度極低，所有的Fe3+幾乎全部沉積在污泥中。此外，含有CuNPs的兩組反應器中含有更高的Fe3+濃度，可能是由于Cu2+的置換，這與2.2節(jié)中的分析一致。

圖3 Control組(a)和Control+Fe組(b)活性污泥中Fe的XPS譜圖以及Sludge-Fe組四個反應器中Fe3+濃度(c)Fig.3 XPS spectra of Fe in activated sludge in the Control group(a)and Control+Fe group(b)and the Fe3+concentration in the four reactors in the Sludge-Fe group(c)

2.4 鐵對關鍵酶活性的影響

在之前的研究中證實了零價鐵對含氮化合物的影響不是直接通過物化反應，而是通過影響微生物從而間接影響氮素的轉化[12]。因此，接下來研究零價鐵對微生物活性與結構的影響。氨單加氧酶（AMO酶)是在氨氧化過程中，將有機氮或者氨氮氧化成羥胺（NH2OH）的關鍵酶。在羥胺被氧化成亞硝酸鹽之后，硝化菌利用亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR酶）將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，完成硝化過程。硝化酶的活力是表征硝化能力強弱的一種指標，通過測定AMO酶和NXR酶的酶活性來解釋TCS、CuNPs對污泥硝化作用的影響。

圖4(a)表示所有反應器中AMO酶的酶活性，Sludge組代表未添加零價鐵的反應器，而Sludge-Fe組代表投加了零價鐵的反應器。以未添加零價鐵的Control組的酶活力為100%，則TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組的酶活力分別為44.7%、11.7%和39.2%，Sludge組的酶活性強弱表現(xiàn)為Control組>TCS組>TCS+CuNPs組>CuNPs組。在引入零價鐵之后，4組反應器中AMO酶的酶活性均有明顯提高，Control組、TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組的酶活性分別是未添加零價鐵系統(tǒng)的1.3倍、1.5倍、2.8倍和1.4倍。

圖4 各反應器中AMO酶活力(a)，NXR酶活力(b)和amoA基因豐度(c)Fig.4 AMO enzyme activity(a),NXR enzyme activity(b)and amoA gene abundance(c)in each reactor

圖4(b)表示各反應器中NXR酶的酶活性。NXR酶的酶活性規(guī)律與AMO酶相似。在Sludge組的酶活性強弱也表現(xiàn)為Control組>TCS組>TCS+CuNPs組>CuNPs組。零價鐵的添加同樣提高了NXR酶的酶活性，Control組、TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組的酶活性分別是未添加零價鐵系統(tǒng)的1.1倍、1.2倍、1.2倍和1.2倍。

相比于NXR酶，AMO酶的酶活力提高程度更顯著，因此進一步對AMO酶的關鍵基因豐度進行測定，結果如圖4(c)所示。本研究中使用2-ΔΔCt值來表達基因豐度，非絕對量。在未添加零價鐵的Control組、TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組中含有的基因豐度分別為1.00、0.35、0.01和0.06，表明在TCS及CuNPs的暴露下，amoA基因的豐度明顯下降，且豐度大小表現(xiàn)為Control組>TCS組>TCS+CuNPs組>CuNPs組。在加入了零價鐵的系統(tǒng)中，Control組、TCS組、CuNPs組 和TCS+CuNPs組 的amoA基因的豐度分別是1.17、0.40、0.05和0.10，與未添加零價鐵的系統(tǒng)相比較，引入零價鐵可以提高硝化功能基因amoA的豐度，進而提高污泥的硝化能力。

綜上可知，在投加零價鐵之后，AMO酶和NXR酶這兩種硝化關鍵酶的酶活性均顯著提高，且AMO酶關鍵基因的表達豐度在投加零價鐵后提高，從而改善了污泥的硝化能力。

2.5 鐵對抗性基因的影響

TCS作為一種廣譜殺菌劑被廣泛利用，其對細菌的暴露可能導致對TCS的抗藥性。本文選擇了涉及TCS耐藥性的mexB基因進行研究，圖5(a)表示各反應器中mexB基因的豐度變化（使用2-ΔΔCt值來表達基因豐度，非絕對量）。在未添加零價鐵的Sludge組中，TCS組和TCS+CuNPs組中的mexB基因的豐度均大于Control組，這說明TCS的暴露增加了mexB基因的豐度，另外，TCS+CuNPs組中的mexB基因的豐度大于TCS組，這可能是由于CuNPs的存在給細菌帶來了選擇性壓力并且促進了mexB基因的傳播[18]。引入零價鐵之后，Control組和TCS+CuNPs組的mexB基因的豐度增大，而TCS組的基因豐度卻明顯下降，這可能與mexB基因的宿主細菌的豐度變化有關。

過量的銅會對細胞造成損害，細菌為維持胞內穩(wěn)態(tài)進化形成了抗銅機制，其中copA基因便是一種典型的銅抗性基因[14]。圖5(b)表示各反應器中copA基因的豐度變化（使用2-ΔΔCt值來表達基因豐度，非絕對量）。在未添加零價鐵的Sludge組中，Control組、CuNPs組和TCS+CuNPs組中copA基因的豐度分別為1、1.04和1.03，沒有產生明顯差別。但是，在投加了零價鐵的系統(tǒng)中，除了Control組，CuNPs組和TCS+CuNPs組的copA基因的豐度均顯著提高，分別為1.34和1.77，這可能是由于置換反應促進了更多鐵離子的生成，使得系統(tǒng)中微生物胞外電子傳遞活動更加頻繁[10]，從而促進了基因的水平轉移。

圖5 各反應器中相關抗性基因的豐度Fig.5 Abundance of related resistance genes in each reactor

綜上所述，TCS和CuNPs這兩種污染物同時存在時會提高相關抗性基因的豐度，而在此基礎上引入零價鐵會進一步提升基因豐度，增加抗性基因的潛在環(huán)境風險。

2.6 零價鐵對微生物結構的影響

2.6.1 零價鐵對門水平微生物結構的影響 污泥硝化作用的核心理論是不同功能的菌種逐步完成相關反應使得水中的氨氮得以去除，所以微生物的群落結構對污泥的硝化功能起著決定性作用。圖6表示在門水平上，各反應器的群落結構組成。在未添加零價鐵的Sludge組[圖6(a)]中，Control組中占據絕對優(yōu)勢的是Proteobacteria，在很多污水處理工藝中，Proteobacteria都占主導地位[18]，它們可以負責氨氮的去除和亞硝態(tài)氮的積累[18]，還包含了很多好氧反硝化菌。除了Proteobacteria，另外三種優(yōu)勢菌是Planctomycetes、Bacteroidetes和Nitrospirae，分 別 占有12.6%、9.8%和3.7%。Bacteroidetes能夠進行反硝化作用[19]，而Nitrospirae具有將亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽的功能[18]，因此，Control組中具有優(yōu)良的氨氮去除能力。TCS組與Control組沒有較大的差異。在CuNPs組中，除了Proteobacteria和Bacteroidetes，優(yōu)勢菌群還有Gemmatimonadetes，豐度分別為53.5%、13.7%和19.2%。在TCS+CuNPs組中，優(yōu)勢菌依次為Proteobacteria、Bacteroidetes和Gemmatimonadetes，分別占有86.6%、7%和5.9%。由于Planctomycetes和Nitrospirae豐度的明顯減少，所以CuNPs組和TCS+CuNPs組中的硝化效果不夠理想。

相較于Sludge組，在添加了零價鐵的Sludge-Fe組[圖6(b)]中，多出了Actinobacteria和Acidobacteria兩種優(yōu)勢菌門。Acidobacteria被證明在鐵的氧化還原反應中發(fā)揮重要作用，且被檢測到在富含鐵礦的環(huán)境中占據主導優(yōu)勢[20]；Actinobacteria能夠產生鐵載體，促進微生物對鐵的吸收[21]，因此零價鐵的加入引起這兩種菌門的微生物豐度大幅增加。此外，鐵刨花中含有零價鐵、碳以及其他金屬，可以在廢水中形成微尺度原電池，因此會促進電化學活性微生物（如Proteobacteria、Actinobacteria和Acidobacteria）的電子傳遞。和Sludge組相比，零價鐵的引入增加了Control組和TCS組中Nitrospirae的相對豐度，也明顯增加了Sludge-Fe組中Bacteroidetes的占比，特別 在CuNPs組和TCS+CuNPs組 中，Bacteroidetes的占比由原先的13.7%、7%分別增長到22.6%、20.7%，這說明了零價鐵的添加不僅可促進硝化作用，還可能促進反硝化作用，具有脫氮功能，與Chen等[12,15]研究結果一致。

圖6 Sludge組(a)和Sludge-Fe組(b)微生物群落結構的差異（門水平）Fig.6 Differences in microbial community structure between Sludge group(a)and Sludge-Fe group(b)(phylum level)

微生物種群結構除了影響生物脫氮，還與系統(tǒng)中抗性基因的富集有關。研究表明，Proteobacteria是TCS抗性基因mexB的微生物載體[22]，在未添加零價鐵的Sludge組中，Proteobacteria的相對豐度表現(xiàn)為TCS+CuNPs組（86.6%）>TCS組（66.4%）>Control組（63.7%），這與mexB基因的豐度變化規(guī)律一致。在加入零價鐵后，各組中Proteobacteria的相對豐度均有明顯下降，宿主細菌豐度的下降導致了TCS+Fe組中mexB基因豐度明顯小于TCS組。然而，在潛在宿主細菌豐度下降時，TCS+CuNPs+Fe組和Control+Fe組中mexB基因豐度明顯增加，這可能是由于Proteobacteria中mexB某些宿主微生物豐度增加導致。

在圖6的幾種優(yōu)勢菌門中，銅抗性基因copA的微生物宿主主要有Proteobacteria和Actinobacteria[23-24]。在未添加零價鐵的系統(tǒng)中，Proteobacteria的相對豐度表現(xiàn)為TCS+CuNPs組（86.6%）>Control組（63.7%）>CuNPs組（53.5%），然而copA基因豐度在三組中沒有明顯差別，表明Proteobacteria中涉及豐富的菌屬，不能對copA基因豐度起決定性作用。添加零價鐵之后，Control+Fe組中Proteobacteria的相對豐度明顯降低，從63.7%減小到58%，但是零價鐵的引入增加了新的優(yōu)勢菌門——Actinobacteria，Proteobacteria的 降 低 與Actinobacteria的增加，最終導致Control組中copA基因豐度的改變不顯著。在CuNPs組中，零價鐵的添加使得Proteobacteria的相對豐度明顯提高，同時還引入了新的copA基因宿主Actinobacteria，copA基因豐度因此明顯提高。在復合組中，零價鐵使得copA基因豐度顯著提升，但是copA基因宿主Proteobacteria的占比從86.6%減小到76.8%，這可能是由于零價鐵促進了copA基因的水平傳播[25]。綜上，宿主細菌的豐度能夠在一定程度上引起兩種抗性基因豐度的變化。

2.6.2 零價鐵對屬水平微生物結構的影響 圖7(a)表示在不添加零價鐵時，各反應器微生物群落在屬水平上的差異。TCS組的群落結構與Control組相差不大，在Control組和TCS組中占比最大的是UnclassifiedMethylophilaceae，分 別 占 有28.1%和28.6%，然 而 在CuNPs組 和TCS+CuNPs組 中，UnclassifiedMethylophilaceae的占比減少至2.9%和2.3%。據報道，Methylophilaceae具有反硝化功能[26]。在Control組中，Rhodobacter的占比近乎為0，然而在CuNPs組和TCS+CuNPs組中，Rhodobacter的占比最大，分別為24.3%和29.1%，Rhodobacter也是一種反硝 化 菌[27]。CuNPs的 存 在 促 進 了Gemmatimonas，Methylotenera和Dechloromonas的增長，這三種菌屬都具有反硝化功能[27]。

圖7 Sludge組(a)和Sludge-Fe組(b)微生物群落結構的差異（屬水平）Fig.7 Differences in microbial community structure between Sludge group(a)and Sludge-Fe group(b)(genus level)

Nitrospira是一種硝化細菌屬，甚至具有完全硝化的能力[28]，在Control組、TCS組、CuNPs組和TCS+CuNPs組中的相對豐度分別為3.7%、2.3%、0.6%和0.2%，TCS、CuNPs的暴露減少了硝化菌的相對豐度，導致污泥硝化能力被抑制。

圖7(b)表示投加了零價鐵之后，各反應器中微生物群落結構的差異。在TCS+CuNPs+Fe組中，由于零價鐵的添加，占比最大的菌屬從Rhodobacter變成了UnclassifiedMethylophilaceae，而其他三組的最大優(yōu)勢菌屬沒有改變。零價鐵的引入明顯增加了Nitrospira在Control+Fe組和TCS+Fe組中的相對豐度，然而在CuNPs+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組中未發(fā)現(xiàn)Nitrospira的明顯增長。在零價鐵的引入后，系統(tǒng)中出現(xiàn)了兩種新的優(yōu)勢菌屬——Lacibacter和Flavobacterium，F(xiàn)lavobacterium屬 于 反 硝 化 菌[5]，Lacibacter屬于Chitinophagaceae，此菌科為異養(yǎng)氨氧化細菌[29]。此外，零價鐵的引入還帶了Dechloromonas的增長，尤其是在單獨加入CuNPs組中，由原來的7.3%變成了20.2%，Dechloromonas可以利用硝酸鹽作為電子供體實現(xiàn)Fe（Ⅱ）的氧化[30]。而對于Methylotenera，零價鐵的引入促進了其在Control+Fe組、TCS+Fe組和TCS+CuNPs+Fe組中 的增長。零價鐵的引入能夠促進Nitrospira和Lacibacter等硝化細菌的增長，改善污泥的硝化性能。此外，零價鐵還提高了Flavobacterium，Dechloromonas和Methylotenera等反硝化細菌的豐度，提高了污泥的反硝化能力。

除了影響脫氮性能，微生物群落的演替也會改變抗性基因的豐度，因此進一步探究本系統(tǒng)中優(yōu)勢微生物與抗性基因的關系。相關研究發(fā)現(xiàn)，Rhodobacter細菌是copA基因的宿主[31]。未添加零價鐵時，在Control組、CuNPs組和TCS+CuNPs組中，Rhodobacter分別占比0%、24.3%和29.1%，Control組中Rhodobacter的相對豐度遠小于其他兩組中，但是三組中copA基因的豐度卻沒有明顯差別。在系統(tǒng)中引入零價鐵之后，Rhodobacter在Control+Fe組和CuNPs+Fe組中的占比均略有提高，然而，在TCS+CuNPs+Fe組中占比明顯減少，從29.1%減少到13.3%。除了空白組之外，零價鐵的添加導致了另外兩組中copA基因豐度的提升，特別是復合組中，從1.03增加到1.77。綜上的現(xiàn)象表明Rhodobacter的相對豐度和copA基因豐度并沒有高度相關性，這可能表明系統(tǒng)中存在著其他copA基因的宿主細菌；此外，對于mexB基因，還沒有相關文獻證明在圖7的優(yōu)勢屬中屬于mexB基因的宿主細菌，因此，可能存在其他mexB宿主細菌，這有待進一步的深入研究。

3 結 論

（1）在TCS、CuNPs的短期及長期暴露下，零價鐵能夠一定程度上減輕TCS和CuNPs對污泥硝化的抑制作用。

（2）反應器經長期運行后，銅離子及未被降解的TCS主要被污泥吸附并在泥相中積累，零價鐵的引入能夠明顯降低銅離子的累積，并促進TCS的降解，從而降低對微生物的毒害作用。

（3）零價鐵可以提高兩種關鍵硝化酶——AMO酶和NXR酶的活性，并且可以提高硝化功能基因amoA的豐度，從而提高污泥的硝化能力。

（4）相比于單獨存在，TCS和CuNPs同時存在時會提高mexB基因和copA基因豐度，而零價鐵的引入也會提高相應抗性基因的豐度。

（5）各反應器中的優(yōu)勢菌門為Proteobacteria，優(yōu)勢菌屬為UnclassifiedMethylophilaceae和Rhodobacter。零價鐵的引入促進了Control+Fe組和TCS+Fe組中硝化菌的增長，也明顯促進了多種反硝化菌豐度的增加。

（6）作為宿主細菌，Proteobacteria的占比會影響mexB基因豐度，Proteobacteria和Actinobacteria的占比會影響copA基因豐度。