陸春菊, 陸玫霖, 劉昕明, 劉永宏,2, 高程海, 徐新亞

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院, 廣西 南寧 530200;

2. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室, 廣東省海洋藥物重點實驗室, 廣東 廣州510301

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)被稱為“海洋中的熱帶雨林”和“藍色沙漠中的綠洲”, 是地球上生物多樣性最豐富的生態(tài)系統(tǒng)之一(趙美霞 等, 2006)。除了魚類和底棲無脊椎動物, 珊瑚還共生或附生有大量的海洋微生物。海洋微生物與珊瑚宿主共生互利, 協(xié)同進化,對于維持珊瑚正常的生理生態(tài)功能、抵御珊瑚病害有重要的作用(黃峰 等, 2019)。并且海洋微生物通常具有抗菌、抗腫瘤等多種生物活性, 是新型功能基因和新型活性肽的重要來源, 也是開發(fā)新型藥物的重要資源(Zhang et al, 2007; Qin et al, 2014;Carroll et al, 2020)。

潿洲島地處北部灣海域, 是我國最大、最年輕的火山噴發(fā)堆積形成的島嶼, 具有熱帶季風(fēng)氣候。潿洲島附近海域分布有大量的珊瑚礁, 屬于世界珊瑚礁分布的北緣, 分布有底棲生物279種, 魚類80種(王文歡 等, 2016)。潿洲島珊瑚共附生微生物多樣性的研究較少。高程海等研究了潿洲島柳珊瑚Anthogorgia caerulea可培養(yǎng)共附生細菌多樣性, 獲得了90株海洋細菌, 并篩選到5株抑制海洋生物污損細菌和污損生物附生的芽孢桿菌屬(Bacillussp.)活性菌株(方燕 等, 2012), 并從該柳珊瑚中分離鑒定了2個亞綱9科9屬23種放線菌, 發(fā)現(xiàn)其中10株放線菌有較強的生物毒活性(楊小梅 等, 2014)。潿洲島珊瑚共附生真菌的研究僅有一篇報道。王亞楠(2012)研究了潿洲島海域的10種柳珊瑚的共附生微生物多樣性, 分離了柳珊瑚共附生海洋真菌242株, 細菌82株。青霉屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus)是柳珊瑚共附生海洋真菌中分離頻率最多的優(yōu)勢屬(王亞楠,2012)。本研究考察了潿洲島珊瑚礁真菌多樣性及其抗菌活性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 柳珊瑚樣本來源

珊瑚樣本采自廣西潿洲島海域, 在水下裝入無菌封口袋密封, 置于冰盒中保存, 運輸至實驗室后用于真菌的分離和鑒定。珊瑚樣本由廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院高程海研究員鑒定為網(wǎng)狀軟柳珊瑚Subergorgia reticulata、Anthogorgiasp.和日本紅珊瑚Corallium japonicum。

1.1.2 指示菌種類

指示菌包括兩種水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌——無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiaeATCC51487, SA)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniaeATCC29178, SI);兩種人類致病菌——表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidisATCC12228, SE)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureusATCC43300, MRSA), 均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院張曉勇副教授惠贈。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

使用的培養(yǎng)基配方如下所示。均經(jīng)121℃高溫高壓滅菌30min后使用。

虎紅培養(yǎng)基(RBM): 蛋白胨5.0g, 葡萄糖10.0g,KH2PO41.0g, MgSO40.5g, 孟加拉紅 0.033g, 瓊脂粉 15.0g, 氯霉素0.1g, 人工海水1000mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA): 馬鈴薯提取粉 6.0g, 葡萄糖 20.0g, 瓊脂粉 15.0g, 氯霉素0.1g,人工海水1000mL。

查氏瓊脂培養(yǎng)基(CDA): NaNO33.0g, K2HPO41.0g, MgSO40.5g, KCl 0.5g, FeSO40.01g, 蔗糖30.0g, 瓊脂粉15.0g, 氯霉素0.1g, 人工海水1000mL。

沙氏培養(yǎng)基(SDA): 蛋白胨10g, 瓊脂 20g,葡萄糖40g, 氯霉素0.1g, 人工海水1000mL。

真菌2號培養(yǎng)基: 甘露醇20g, 酵母膏3g,MgSO40.3g, 谷氨酸鈉10g, 葡萄糖10g, KH2PO40.5g, 麥芽糖20g, 人工海水1000mL。

LB培養(yǎng)基: 胰蛋白胨10g, 酵母提取物5g, 氯化鈉10g, 水1000mL, 調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.1.4 真菌分離培養(yǎng)

柳珊瑚樣品在超凈工作臺中用75%乙醇淋洗1次后, 再用無菌海水淋洗3次, 在研缽中剪碎, 研磨成勻漿, 得到樣品原漿。用無菌海水按1:5、1:10、1:100的比例稀釋后, 分別吸取100μL稀釋液加入RBM、CDA、PDA、SDA培養(yǎng)基平板中, 用無菌涂布棒涂布均勻后, 封口, 放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中, 反復(fù)用滅菌竹簽挑取單菌落接種于PDA培養(yǎng)基上, 純化菌株。

1.1.5 真菌鑒定

在超凈工作臺中從培養(yǎng)平板上刮取一定量菌絲體和孢子, 放入無菌的2mL離心管中, 密封后送至昊天(廣州)生物公司進行ITS-rDNA測序。PCR擴增使用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。所有測序結(jié)果使用seqman軟件分析剪切, 在NCBI通過序列比對引擎BLAST, 將測序得到的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行比對分析。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和序列比對結(jié)果對真菌進行排重, 將排重后真菌的基因序列上傳到GenBank, 獲取登錄號?；贛EGA-X軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining, N-J)構(gòu)建柳珊瑚共附生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(Kumar et al, 2018)。

1.1.6 真菌發(fā)酵液粗提物制備

將純培養(yǎng)所得菌株接種于真菌2號培養(yǎng)基中,28℃, 180r·min-1震蕩培養(yǎng)7d。等體積乙酸乙酯浸泡,40kHz超聲提取20min, 真空抽濾, 靜置分層, 棄去水層, 乙酸乙酯層減壓濃縮后得到提取物。提取物用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶液溶解,配置成20mg·mL-1的樣品液, 備用。

1.1.7 抑菌活性篩選

采用96孔板法測定樣品對表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、海豚鏈球菌3種指示菌的抑菌活性?；罨蟮闹甘揪臃N于LB培養(yǎng)基, 30℃, 180r·min-1震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期, 調(diào)整菌懸液濃度為每毫升含有106個菌落形成單位(colony forming units, CFU)。用移液槍吸取195μL菌懸液, 加入96孔板, 再加入5μL樣品液,搖勻密封后, 于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h, 使用酶標儀于600nm條件下測定OD值。以初濃度為1mg·mL-1的青霉素G為陽性對照; 同時設(shè)置陰性對照和空白對照, 每個樣品設(shè)置3個平行樣。樣品抑菌活性結(jié)果用抑制率表示。抑制率=(空白值-樣品值)/空白值×100%。

1.1.8 抗生物膜活性篩選

采用結(jié)晶紫染色法測定抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物被膜形成活性?；罨笾甘揪臃N于LB培養(yǎng)基, 30℃, 180r·min-1震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期, 調(diào)整菌懸液濃度為106CFU·mL-1。用移液槍吸取195μL菌懸液, 加入96孔板, 再加入5μL各濃度樣品液, 搖勻密封后, 于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。傾去菌液, 水洗2遍, 60℃烘干。加入0.5%結(jié)晶紫200μL, 染色30min。傾去結(jié)晶紫溶液, 水洗2遍, 60℃烘干。加入30%乙酸200μL溶解, 靜置30min后于酶標儀540nm波長測定OD值。樣品抑菌活性結(jié)果用半數(shù)最小抑菌濃度表示。半數(shù)最小抑菌濃度為抑制50%受試菌所需最小抑菌濃度(50%minimal inhibitory concentration, MIC50)。樣品抗生物被膜活性結(jié)果用半數(shù)效應(yīng)濃度(median effect concentration, EC50)表示。

2 結(jié)果和分析

2.1 可培養(yǎng)真菌的分離結(jié)果

采集廣西北部灣潿洲島海域10株柳珊瑚, 對柳珊瑚新鮮組織樣本進行共附生真菌的分離純化, 得到191株可培養(yǎng)共附生海洋真菌(表1), RBM培養(yǎng)基分離得到60株真菌, 數(shù)量最多, 占總分離菌株33.03%。

表1 10株柳珊瑚共附生真菌的分離數(shù)量Tab. 1 Numbers of isolates from the 10 gorgonians

2.2 可培養(yǎng)真菌的多樣性

從10株柳珊瑚共計分離得到191株純培養(yǎng)真菌,形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS序列比對排重后得到26個種屬共附生海洋真菌(表2), 基于N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。菌株的ITS序列經(jīng) BALST檢索, 均能找到相似度97%以上的匹配序列?；贗TS序列比對分析, 26種真菌分布于子囊菌門的5目6屬: 散囊菌目(Eurotiales)的曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)、格孢菌目(Pleosporales)的鏈格孢屬(Alternaria)、枝孢菌目(Capnodiales)的枝孢菌屬(Cladosporium)、假毛球殼目(Trichosphaeriales)的黑孢霉屬(Nigrospora)和肉座菌目(Hypocreales)的(Parengyodontium)。有18種為曲霉屬真菌, 表明曲霉屬(Aspergillus)為廣西北部灣柳珊瑚可培養(yǎng)共附生真菌的優(yōu)勢屬, 占總菌株種類的69.23%, 次優(yōu)屬為枝孢菌屬(Cladosporium)。

圖1 基于N-J法對26株柳珊瑚共附生真菌的ITS-rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Neighbor-Joining tree based on fungal ITS-rDNA sequences of 26 fungal isolates

表2 基于ITS序列分析鑒定的柳珊瑚共附生真菌Tab. 1 Identification of fungal strains isolated from gorgonians based on DNA analysis of the ITS region

2.3 抑菌活性篩選

26株柳珊瑚共附生真菌進行液體發(fā)酵, 制備乙酸乙酯粗浸膏, 進行抑菌活性篩選, 在濃度為400μg·mL-1時, 發(fā)現(xiàn)有11種真菌至少對一種指示菌具有抑制作用, 占菌株總數(shù)的42.31% (表3)。其中菌株P(guān)enicillium citrinumGXIMD00507,Penicillium cinnamopurpureumGXIMD00518和Aspergillus unguisGXIMD00521對3種指示菌具有較好抑制作用, 抑制率高于75%。

表3 真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物抑制細菌活性實驗結(jié)果Tab. 3 Antibacterial activities of ethyl acetate (EtOAc) extracts from fermentation broth of the gorgonian-derived fungal strains

2.4 抗生物被膜活性篩選

26株海洋真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物進行抗細菌生物被膜實驗(表4), 發(fā)現(xiàn)有7株真菌對表皮葡萄球菌表現(xiàn)出抗生物被膜活性, 占菌株總數(shù)的27%,EC50濃度范圍為40.3～155μg·mL-1。菌株P(guān).cinnamopurpureumGXIMD00518和A. carneusGXIMD00519有抗MRSA生物被膜形成活性, EC50值分別為105.4μg·mL-1和117.4μg·mL-1。

表4 真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物抗生物被膜活性實驗結(jié)果Tab. 4 Anti-biofilm activities of EtOAc extracts from fermentation broth of the gorgonian-derived fungal strains

3 討論

本研究首次于廣西北部灣海域分離得到Parengyodontium屬真菌, 豐富了對該海域海洋真菌多樣性的認識。P. album, 是一種重要的蛋白酶產(chǎn)生菌(Ren et al, 2020), 曾用名Engyodontium album,2016年Tsang等將其轉(zhuǎn)移到新屬Parengyodontiumgen. nov., 確立新名稱為Parengyodontium album。該菌株曾從廈門市集美區(qū)紅樹林海泥中分離得到(傅奇 等, 2020), 黃艷冰等(2018)在南海海域葉狀薔薇珊瑚也曾分離到該菌株, 進一步從其發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的苯并二氫吡喃酮類化合物對MRSA具有較好的抑制作用。

無乳鏈球菌又叫B群鏈球菌(GBS), 屬芽孢桿菌綱Bacilli、乳桿菌目Lactobacillales、鏈球菌科Streptococcaceae、鏈球菌屬Streptococcus, 是一種人類、牲畜和魚類共患病致病菌。人源性無乳鏈球菌可寄生于母體生殖道, 并可引起嬰兒感染。還可引起產(chǎn)后感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚軟組織感染、骨髓炎。魚源性無乳鏈球菌傳染性強, 致死率高, 羅非魚是最敏感的宿主, 感染后死亡率高達80%, 造成巨大經(jīng)濟損失; 藥物是防控無乳鏈球菌的主要手段,但其對常用抗生素如青霉素、紅霉素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感性不斷下降(蘇友祿 等, 2019; 張行 等,2020)。Kong等(2018)自一株海綿來源真菌Aspergillus fumigatusHNMF0047分離得到的螺戊酸, 以及兩個新的螺戊酸衍生物16-O-propionyl-16-O-deacetylhelvolic acid 和 6-O-propionyl-6-O-deacetylhelvolic acid抑制無乳鏈球菌的MIC值分別為8μg·mL-1、16μg·mL-1和2μg·mL-1, 均強于陽性對照妥布霉素的MIC值(32μg·mL-1)?？梢? 海洋天然產(chǎn)物是發(fā)現(xiàn)防控無乳鏈球菌藥物的潛在資源。而本研究發(fā)現(xiàn)菌株P(guān). citrinumGXIMD00507、P. cinnamopurpureumGXIMD00518和A.unguisGXIMD00521對無乳鏈球菌具有良好的抑菌活性,可為開發(fā)抗無乳鏈球菌的新型抗菌藥物提供參考。

海豚鏈球菌屬芽孢桿菌綱Bacilli、乳桿菌目Lactobacillales、鏈球菌科Streptococcaceae、鏈球菌屬Streptococcus, 具有感染宿主廣、傳染性強、死亡率高等特點。海豚鏈球菌可以感染30多種魚類, 導(dǎo)致其發(fā)病, 嚴重威脅到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展(羅曉雯 等, 2018)。本研究有5株真菌對海豚鏈球菌的抑制率達到80%以上, 菌株A. sydowiiGXIMD00516也表現(xiàn)出抑制活性。Liu等(2017)曾從海綿共附生真菌A. sydowiiJ05B-7F-4中分離到抑制海豚鏈球菌的活性化合物ViolaceolⅡ和Cordyol E。

細菌生物被膜(biofilm, BF)是多個細菌黏附于非生物或生物表面。分泌多聚物基質(zhì)并將自身包裹其中形成的一種有組織的細菌集團。生物被膜的形成可以增強細菌的耐藥性, 生物被膜內(nèi)細菌較其浮游狀態(tài)對抗生素的耐藥性可提高100～l000倍(Jin et al, 2014);臨床上, 人類65%～80%的疾病是由生物被膜造成的(Ding et al, 2019)。MRSA生物被膜一旦生成, 傳統(tǒng)的抗MRSA感染用藥如萬古霉素和利奈唑胺等很難將其清除。許多天然產(chǎn)物被證明具有破壞細菌生物被膜或使生物被膜對抗菌藥物敏感的活性作用, 有望開發(fā)成更高藥理活性的抗生物被膜藥物(Melander et al,2020)。海洋環(huán)境因其特殊的物理和化學(xué)條件, 幾乎每一類海洋生物都表現(xiàn)出分子的結(jié)構(gòu)特異性, 表現(xiàn)出豐富的生物活性。從海綿中分離出的二萜類化合物Darwinolide, 抑制MRSA的MIC值為132.9μmol·L-1,抗MRSA生物被膜EC50值為33.2μmol·L-1(von Salm et al, 2016)。本研究發(fā)現(xiàn)兩株柳珊瑚共附生真菌P.cinnamopurpureumGXIMD00518和A. carneusGXIMD00519發(fā)酵液粗提物有抗MRSA生物被膜形成活性, EC50值分別為105.4μg·mL-1和117.4μg·mL-1,有開發(fā)有效抗MRSA生物被膜形成藥物的前景, 值得對其次級代謝產(chǎn)物進行探索。

表皮葡萄球菌是條件致病菌, 進入人體后, 通過黏附生成生物被膜, 可導(dǎo)致敗血癥, 已上升為醫(yī)院感染率排名的前4位(張青 等, 2003)。本研究發(fā)現(xiàn)有11種具有抑菌作用的柳珊瑚共附生真菌均能抑制表皮葡萄球菌, 菌株P(guān). cinnamopurpureumGXIMD00518和A. unguisGXIMD00521對表皮葡萄球菌的抑制率分別為86.84%和88.17%, 并有7種真菌對表皮葡萄球菌表現(xiàn)出抗生物被膜活性, 占菌株總數(shù)27%, EC50濃度范圍為40.3～155μg·mL-1。