付 寅，趙洪育，陳遠才，李俊強，張龍現

畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)和芽囊原蟲(Blastocystissp.)是2種常見的可引起人和多種動物腸道疾病的重要人獸共患病病原。畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲廣泛存在于自然界的腸道寄生蟲，主要通過糞口傳播，可感染包括人類在內的多種哺乳動物，主要引起腹瀉等消化道疾病[1-2]。畢氏腸微孢子蟲還可引起宿主角膜炎、心肌炎、腦炎、泌尿系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病[3]，芽囊原蟲為引起腸易激綜合征的重要病原體[4]。

基于畢氏腸微孢子蟲ITS基因型至少可分成11個組(group)，其中group1為主要人獸共患基因型，其余的大部分有其宿主特異性。在牛科動物中發(fā)現了超過50種基因型，其中屬于group1中的D、Type IV、Peru6、CHN4、EbpA和group2中的基因型J、I、BEB4、BEB6、CHN3、CS-4、EbpC曾在人類中檢測到[5-6]。目前公認芽囊原蟲有17種亞型(ST1～ST17)，其中ST1～ST9和ST12曾在人類中檢出，ST3、ST5、ST6亞型在牛中較為常見[7-8]。

河南省為新興的奶業(yè)大省，近年來更加注重奶業(yè)發(fā)展，將發(fā)展奶業(yè)作為農業(yè)供給側結構性改革的重點。截至2020年，河南省奶牛存欄總量達34.2萬頭，乳產品產量居全國前列。畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲作為奶牛中常見的腸道寄生蟲，可造成奶牛生長緩慢和產奶量下降甚至死亡[2-3]。本研究對河南地區(qū)奶牛微孢子蟲和芽囊原蟲的感染情況及基因型分布進行調查，評估河南奶牛微孢子蟲和芽囊原蟲潛在的人獸共患病傳播風險。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 2019年7月到2020年7月期間，于河南省中牟、滎陽、許昌、原陽、新鄭5個行政區(qū)的10個奶牛場共采集1 020份奶牛新鮮糞樣。為避免交叉污染，每次采樣均使用一次性塑料袋收集，并記錄采樣地點和年齡信息，封存于一次性自封袋中，當天運送到河南農業(yè)大學寄生蟲實驗室，保存于4℃冰箱中待檢。

1.2 樣品分裝和DNA提取 所采集的糞便樣品，每份取200 mg轉移到1.5 mL離心管中，使用Stool DNA Kit(E.Z.N.A Stool DNA kit, OMEGA)提取糞便中病原的全基因組DNA，按照試劑盒推薦說明書進行操作，獲得的DNA保存于—20 ℃冰箱。

1.3 PCR檢測 畢氏腸微孢子蟲基于ITS基因位點進行巢式PCR檢測，引物設計及PCR擴增參考Buckholt等發(fā)表的方法[9]。芽囊原蟲基于SSU rRNA基因位點進行PCR檢測，引物設計及PCR擴增參考Scicluna等發(fā)表的方法[10]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及退火溫度見表1。

表1 畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲引物序列Tab.1 Primer sequences for E. bieneusi and Blastocystis sp.

1.4 序列分析與基因型鑒定 陽性PCR產物低溫運送至北京諾賽基因有限公司，使用ABIPRISMTM 3730XL DNA測序儀進行雙向測序。使用Chormas 2.6(https://chromas.software.informer.com)和MEGA 7.0(https://megasoftware.net)軟件對比校正雙向測序結果。將校正后的序列于NCBI GenBank(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中進行序列檢索以確定畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲的種類及基因型。

1.5 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學分析使用IBM SPSS Statistics 22軟件，采用χ2檢驗分析不同地區(qū)及年齡段奶牛的畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲感染率的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 各地區(qū)畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲感染率 對1 020份奶牛糞便樣本的DNA進行巢式PCR檢測，共檢測到221份畢氏腸微孢子蟲陽性樣品和196個芽囊原蟲陽性樣品，所有陽性樣本均成功測序。通過將獲得的陽性樣品序列在線Blast同源性比對均在98%～100%。結果顯示此次調查檢測的微孢子蟲和芽囊原蟲感染率分別為21.7%(221/1 020)和19.2%(196/1 020)，其中2種病原的混合感染率為3.5%(36/1 020)。

不同地區(qū)奶牛畢氏腸微孢子蟲的檢出率，中牟地區(qū)(31.8%,68/214)顯著大于滎陽(19.1%,81/424)(χ2=12.758,P<0.01)和新鄭(17.3%,19/110)(χ2=7.780,P<0.01)。許昌和原陽地區(qū)畢氏腸微孢子蟲的檢出率分別為22.4%(15/67)和18.5%(38/205)。

不同地區(qū)奶牛芽囊原蟲檢出率，滎陽地區(qū)(34.0%，144/424)明顯大于中牟(10.3%，22/214)(χ2=41.436，P<0.001)、原陽(1.5%，3/205)(χ2=81.497，P<0.001)、新鄭(12.7%，14/110)(χ2=18.904，P<0.001)和許昌(19.4%，13/67)(χ2=5.638，P=0.018)。而原陽地區(qū)明顯低于中牟(χ2=14.507，P<0.001)、滎陽 (χ2=81.497，P<0.001)、許昌(χ2=29.354，P<0.001)、新鄭(χ2=17.790，P<0.001)4個地區(qū)。河南省這 5個地區(qū)奶牛場畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲檢出率及基因型分布詳見表2。

表2 各養(yǎng)殖場畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲感染率和基因型Tab.2 Prevalence and genotypes of E. bieneusi and Blastocystis sp. in different farms

2.2 各年齡段奶牛畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲感染率 分析不同年齡段奶牛畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲感染率發(fā)現，6月齡以上的畢氏微孢子蟲感染率13.0%(71/548)，明顯低于6月齡以下奶牛的感染率31.8%(150/472)(χ2=52.940,P<0.001)，6月齡以內奶牛畢氏腸微孢子蟲感染率較高；芽囊原蟲在4個年齡段感染率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=45.013,P<0.01)，其中1～6月齡和12月齡以上的奶牛芽囊原蟲感染率較高(圖1、圖2)。

注：柱狀圖表示不同基因型畢氏腸微孢子蟲陽性數量，折線圖反映各年齡段感染率變化。圖1 各年齡段奶牛畢氏腸微孢子蟲感染率及基因型Fig.1 Infection and genotype distribution of E. bieneusi in different age groups

注：柱狀圖表示不同基因型芽囊原蟲陽性數量，折線圖反映各年齡段感染率變化。圖2 各年齡段奶牛芽囊原蟲感染率及基因型Fig.2 Infection and genotype distribution of Blastocystis sp. in different age groups

2.3 畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲序列分析及基因型鑒定 畢氏腸微孢子蟲共檢測到9種基因型，分別為J(126)、BEB4(25)、BEB6(22)、HNWW2(21)、I(16)、D(6)、CHG2(4)、NHD1(2)、EbpA(2)。其中基因型J為優(yōu)勢基因型，占比57.0%，其次為基因型BEB4(11.3%)、BEB6(10.0%)、HNWW2(9.5%)和I(7.2%)。

芽囊原蟲共檢測出6種基因型，分別為ST10(111)、ST5(39)、ST14(37)、ST4(6)、ST2(2)、ST1(1)。其中ST10占比56.6%，為此次調查研究的芽囊原蟲優(yōu)勢基因型，隨后為ST5(19.9%)和ST14(18.9%)。

3 討 論

畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲在世界范圍內感染人類和多種哺乳動物，本次調查顯示河南地區(qū)奶牛畢氏腸微孢子蟲總體感染率為21.7%(221/1 020)，Zhang等[11]報道顯示全世界?？苿游锂吺夏c微孢子蟲的感染率為3.1%～37.6%，此次調查結果也在此范圍內。本研究顯示奶牛微孢子蟲感染率與年齡相關，成年牛和育成牛感染率大于犢牛，這與從前的報道相符合[13-16]。報道顯示畢氏腸微孢子蟲感染率還與糞便狀態(tài)、養(yǎng)殖模式、季節(jié)等因素有關，腹瀉樣品相對于正常糞便樣品更易檢出，圈養(yǎng)奶牛感染微孢子蟲的風險顯著低于放養(yǎng)奶牛[12]，微孢子蟲在秋季的檢出率顯著低于春季[11]。樣品采集的季節(jié)以及樣品中來源于放養(yǎng)奶牛的比例、各年齡段奶牛所占比例是造成感染率差異的部分影響因素。

本研究調查河南地區(qū)奶牛芽囊原蟲感染率為19.2%(196/1 020)，顯著高于東北地區(qū)奶牛的感染率10.3%(54/526)[17]和黑龍江地區(qū)感染率9.5%(14/147)[18]，以及廣東地區(qū)的感染率1.88%(9/479)[19]。世界各國奶牛芽囊原蟲感染率為2.9%～54.1%[20-23]。報道顯示3—12月齡牛感染率較高[21]，6月齡以上的牦牛感染率較高[24]，此次研究顯示1—6月齡及12月齡以上奶牛感染率較高，不同年齡段奶牛芽囊原蟲感染率沒有明顯的線性關系，該結論與兩者研究結論不盡相同，但部分重疊；夏季的牛芽囊原蟲檢出率顯著高于其他季節(jié)[21-24]，正常糞便芽囊原蟲檢出率顯著高于水樣糞便和血樣糞便等其他糞便類型[21]。奶牛芽囊原蟲感染率可能受年齡、季節(jié)以及糞便狀態(tài)影響，但具體的規(guī)律仍需要更多的研究進一步證明。

本次調查研究共檢測出9種畢氏腸微孢子蟲ITS基因型(D、J、I、BEB4、BEB6、NHD1、HNWW2、CHG2、EbpA)，其中5種為潛在的人獸共患基因型，分別為屬于group1的基因型D(6例)和group2的基因型J(126例)、I(16例)、BEB4(25例)、BEB6(22例)。畢氏腸微孢子蟲亞型J分布范圍最廣，檢出率占比最高(57.0%)，為此次研究中畢氏腸微孢子蟲的優(yōu)勢基因型。與之前的報道一致[11]。本次調查共檢測出6種芽囊原蟲基因型(ST1、ST2、ST4、ST5、ST10、ST14)，其中ST1、ST2、ST4、ST5為人獸共患基因型，ST1和ST2僅檢測到1例，ST4檢測到5例，ST5檢測到35例。芽囊原蟲ST10檢出率占比最高(56.6%)為此次研究中的優(yōu)勢基因型；而人獸共患基因型ST5在5個地區(qū)奶牛場中均有檢出。

不同年齡段奶牛的畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲感染情況有所差異，并且6月齡以內的奶牛畢氏腸微孢子蟲感染率較高；而芽囊原蟲感染率在各個年齡段差異顯著，但是沒有觀察到明顯的分布規(guī)律，畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲均主要通過糞口傳播，并且作為機會致病性病原，對免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟的犢牛危害較大，因此應該加強對犢牛的管理，及時清理糞便，勤換墊料。

本研究對河南省奶牛畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲流行情況進行了分子流行病學調查研究，首次報道了河南省奶牛芽囊原蟲的流行及基因分布情況。畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲在各個年齡段奶牛中均有檢出，且有人獸共患基因型檢出，表示河南地區(qū)奶牛微孢子蟲和芽囊原蟲有人獸共患風險，需做好防控措施。