BMSCs來(lái)源外泌體調(diào)節(jié)表皮HaCaT細(xì)胞及對(duì)燒傷創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用

唐強(qiáng)　黃志群　廖秋姣　陳端凱　陸鋼　姜艷　唐乾利

[摘要]目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的外泌體對(duì)表皮細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）增殖、侵襲與遷移的影響，以及對(duì)小鼠燒傷創(chuàng)面愈合的作用。方法：分離培養(yǎng)小鼠的BMSCs，超速離心法收集BMSCs來(lái)源的外泌體，采用BMSCs來(lái)源的外泌體培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)BMSCs來(lái)源的外泌體對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSCs來(lái)源的外泌體對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移與侵襲的影響。選取25只C57BL/6小鼠構(gòu)建燒傷模型，22只成功建模，將存活小鼠分為對(duì)照組和外泌體組，每組11只，外泌體組燙傷周?chē)⑸銪MSCs來(lái)源的外泌體，對(duì)照組小鼠同時(shí)注射等體積PBS溶液。采用Image J軟件分析小鼠創(chuàng)面愈合率，通過(guò)HE染色觀察創(chuàng)面組織學(xué)變化，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)創(chuàng)面組織中炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）的水平，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)創(chuàng)面組織Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）和Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）表達(dá)。結(jié)果：成功分離培養(yǎng)出小鼠BMSCs，并得到BMSCs來(lái)源的外泌體。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞增殖活性明顯升高;細(xì)胞的劃痕愈合率較對(duì)照組顯著升高，細(xì)胞侵襲數(shù)目較對(duì)照組也顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組小鼠比較，經(jīng)BMSCs來(lái)源的外泌體處理的小鼠，第3、7、14、21、28天的創(chuàng)面愈合率顯著升高，創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)得到明顯改善，且組織中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量均顯著降低，而抗炎因子IL-10的含量顯著升高，Ⅲ型膠原表達(dá)明顯，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：BMSCs外泌體可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移能力，并減輕小鼠燒傷創(chuàng)面組織的炎癥程度，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

[關(guān)鍵詞]燒傷;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;外泌體;HaCaT細(xì)胞;創(chuàng)面愈合

[中圖分類(lèi)號(hào)]R644? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）09-0001-06

Exosomes Derived from BMSCs Regulate Epidermal HaCaT Cell and Promote Burn Wound Healing

TANG Qiang1，HUANG Zhi-qun1，LIAO Qiu-jiao2，CHEN Duan-kai1，LU Gang1，JIANG Yan3，TANG Qian-li3

（1.Department of Burn Plastic Surgery and Wound Repair Surgery;2.Department of Spine and Bone Surgery，Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China;3.Youjiang Medical College for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of exosomes secreted by bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） on the proliferation， invasion and migration of human keratinocytes （HaCaT cells）， and on the healing of burn wounds in mice. Methods? BMSCs from mice were isolated and cultured， exosomes derived from BMSCs were collected by ultracentrifugation， HaCaT cells were cultured with exosomes derived from BMSCs， and the effect of exosomes derived from BMSCs on the proliferation of HaCaT cells was detected by CCK-8 method. Scratch test and Transwell test were used to detect the influence of BMSCs-derived exosomes on HaCaT cell migration and invasion. Twenty-five C57BL/6 mice were selected to construct a burn model. After successful modeling （n=22）， the surviving mice were divided into a control group and an exosome group， with 11 in each group. Exosomes derived from BMSCs were injected around the scald in the exosomes group， and mice in the control group were injected with an equal volume of PBS solution at the same time. Image J software was used to analyze the wound healing rate of mice， and the histological changes of the wound were observed by HE staining. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the levels of inflammatory factors tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-10 （IL-10） in wound tissue. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of type Ⅰ collagen （Col Ⅰ） and type Ⅲ collagen （Col Ⅲ） in wound tissue. Results? The mouse BMSCs were successfully isolated and cultured， and exosomes derived from BMSCs were obtained. Compared with the control group， the HaCaT cell proliferation activity in the experimental group was significantly increased; the scratch healing rate of the cells was significantly higher than that of the control group， and the number of cell invasion was also significantly higher than that of the control group. The differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with control mice， mice treated with BMSCs-derived exosomes had a significantly higher wound healing rate on days 3， 7， 14， 21 and 28， the tissue structure of the wound was significantly improved， and the contents of pro-inflammatory factors TNF-α and IL-1β in the tissues are significantly reduced， while the content of anti-inflammatory factor IL-10 is significantly increased. The expression of type Ⅲ collagen was obvious， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion? BMSCs exosomes can promote the proliferation， invasion and migration of HaCaT cells， reduce the inflammation degree of burn wound tissue in mice， and promote wound healing.

Key words： burn; bone marrow mesenchymal stem cells; exosomes; HaCaT cells; wound healing

燒傷是一種極其復(fù)雜的外傷性疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，每年大約有30多萬(wàn)人因燒傷致使死亡，并造成1 000多萬(wàn)傷殘調(diào)整壽命年的損失[1-2]。燒傷后皮膚發(fā)生變性，引起組織形態(tài)發(fā)生變化、細(xì)胞代謝紊亂和功能受損，而燒傷后傷口愈合也是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及炎癥、增殖和重塑三個(gè)階段[3]，促進(jìn)皮膚傷口愈合的目標(biāo)是快速再生皮膚的天然保護(hù)結(jié)構(gòu)，以減少感染的風(fēng)險(xiǎn)并提供組織的功能性[4]。人永生化表皮細(xì)胞HaCaT在創(chuàng)傷及周?chē)糠值脑鲋撑c遷移是創(chuàng)面再上皮化和創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[5]。

目前，燒傷的治療方法主要包括基因治療、生長(zhǎng)因子治療、富血小板血漿治療、干細(xì)胞治療和組織工程[6]。其中，基于干細(xì)胞的療法是治療急性和慢性傷口愈合的重要途徑。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）可用于多種疾病的治療，同時(shí)能夠分泌有利于細(xì)胞修復(fù)和生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)因子[7]。為進(jìn)一步探索基于BMSCs外泌體的治療方法，本研究通過(guò)提取BMSCs來(lái)源的外泌體，觀察其對(duì)HaCaT細(xì)胞功能學(xué)的影響，并在燒傷小鼠上初步觀察了其對(duì)創(chuàng)面愈合的作用，為后續(xù)BMSCs來(lái)源的外泌體治療創(chuàng)面損傷的機(jī)制研究提供依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～24g，均在右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.1.2 主要材料、試劑：HaCaT細(xì)胞株（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心），胎牛血清、青霉素-鏈霉素、DMEM培養(yǎng)液及胰蛋白酶（美國(guó)Gibco 公司），ELISA檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），HE染色試劑和免疫組化染色試劑（北京索萊寶），茜素紅染色試劑盒和油紅O染色試劑盒（北京中杉金橋），成骨和成脂分化培養(yǎng)基（中國(guó)賽業(yè)），CCK-8試劑盒（日本同仁），Transwell小室（美國(guó) System Biosciences 公司），抗體CD34、CD29、CD45、CD44、Col Ⅰ和Col Ⅲ（英國(guó)Abcam 公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定：采用全骨髓貼壁法提取C57BL/6小鼠的BMSCs。將小鼠脫臼處死，在無(wú)菌環(huán)境下分離兩側(cè)股骨和脛骨，PBS沖洗骨髓腔，細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液原代培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，每2d換液1次，去除未貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化。收集第3代BMSCs，1 000rpm/min離心5min，制成細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度為1×105個(gè)/毫升，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34、CD29、CD45、CD44表達(dá)。第3代BMSCs分別使用成骨完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)21d和成脂分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)14d后，進(jìn)行茜素紅染色和油紅O染色。

1.3 BMSCs的外泌體提取及鑒定：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs，PBS漂洗后，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)上清液，4℃離心機(jī)中以300g離心10min，取上清液，以2 000g離心20min，取上清液，繼續(xù)以10 000g離心30min，留取上清液，濾膜過(guò)濾，再以100 000g離心1.5h，棄去上清液得到外泌體沉淀，加入PBS重懸，獲得外泌體懸液。采用透射電子顯微鏡觀察外泌體，NTA測(cè)量外泌體的直徑與濃度，Western blot檢測(cè)BMSCs外泌體蛋白標(biāo)志物Alix、TSG101、CD9表達(dá)。

1.4 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理：HaCaT細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化，并以1：3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)：將HaCaT細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞使用含10μg/ml BMSCs來(lái)源的外泌體的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、1、3、5、7d時(shí)，每孔加10μl CCK-8，繼續(xù)孵育4h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處各孔吸光光度值。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的上室加50μl稀釋的Matrigel膠，放于37℃培養(yǎng)箱中待膠凝固。將HaCaT細(xì)胞分組處理48h后，調(diào)整濃度為2×104個(gè)/毫升。取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，對(duì)照組的下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組的下室加入含10μg/ml外泌體的完全培養(yǎng)基。置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗滌并封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝圖像，統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將HaCaT細(xì)胞分組處理48h后，調(diào)整細(xì)胞濃度以4×105個(gè)/孔接種在6孔板中培養(yǎng)24h，用移液管尖端沿直尺垂直于培養(yǎng)孔背后的中間處劃一道痕，PBS清洗細(xì)胞，并沖掉劃痕下細(xì)胞，添加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0h和48h時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍攝圖像，采用Image J軟件分析劃痕愈合情況。

1.8 動(dòng)物造模、分組與處理：小鼠通過(guò)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，剔除背部毛，大小為2cm×2cm。將小鼠在燙傷板上固定后，背部剃毛區(qū)域皮膚均勻涂抹無(wú)水酒精，涂抹后立即點(diǎn)燃，15s后迅速撲滅，即制成深Ⅱ度燒傷小鼠模型，接著腹腔注射0.5ml乳酸林格液，將小鼠單籠飼養(yǎng)，期間自由飲水和攝食。造模后，25只小鼠中有3只死亡，將余下22只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和外泌體組，每組11只，外泌體組小鼠在燙傷周?chē)⑸?ml PBS溶液重懸的BMSCs來(lái)的外泌體（0.2mg/ml），對(duì)照組小鼠同時(shí)注射等體積PBS溶液。

1.9 燒傷創(chuàng)面愈合率：小鼠造模并進(jìn)行相應(yīng)處理后，在第3、7、14、21、28天觀察創(chuàng)面愈合情況，以透明紙和方格紙描畫(huà)出創(chuàng)面大小，Image J軟件分析創(chuàng)面面積，創(chuàng)面愈合率（%）=[（初始創(chuàng)面面積﹣測(cè)定創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積]×100%，以確定傷口愈合程度。

1.10 HE染色：在BMSCs來(lái)源的外泌體處理后第7、14、21、28天，取小鼠創(chuàng)面組織樣本進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估，將創(chuàng)面組織在4%多聚甲醛固定后，經(jīng)漂洗、脫水處理，常規(guī)石蠟包埋后進(jìn)行切片，以獲得厚度為5μm的石蠟切片。取部分切片常規(guī)行HE染色，通過(guò)顯微鏡觀察創(chuàng)面組織學(xué)變化情況。

1.11 ELISA檢測(cè)：在BMSCs來(lái)源的外泌體處理后第28 天，取小鼠創(chuàng)面組織制成組織勻漿，4 000rpm/min離心10min，獲取上清液，采用ELISA測(cè)定組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-10的水平，步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.12 免疫組織化學(xué)染色：創(chuàng)面組織石蠟切片脫蠟、脫水后，使用0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）在微波爐中進(jìn)行高溫抗原修復(fù)，室溫冷卻，加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶處理15min，室溫下5%山羊血清封閉1h，加入稀釋的兔抗Col Ⅰ（1：500）與Col Ⅲ（1：500）為第一抗體，置于4℃下孵育過(guò)夜，第2天，PBS洗滌，加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1：1 000），37℃下孵育30min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，通過(guò)顯微鏡下觀察并拍攝圖像，Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行測(cè)定分析。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定結(jié)果：通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs上細(xì)胞表面抗原CD34，CD29，CD45以及CD44的表達(dá)，結(jié)果顯示，CD29和CD44呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD34和CD45呈陰性表達(dá)（見(jiàn)圖1A）。倒置顯微鏡下觀察到BMSCs形態(tài)均勻，細(xì)胞呈紡錘形，并呈螺旋狀排列（見(jiàn)圖1B）。BMSCs油紅O染色結(jié)果顯示，在細(xì)胞內(nèi)部可觀察到紅色的脂滴（見(jiàn)圖1C）。茜素紅染色觀察到有明顯的橘紅色鈣沉淀，說(shuō)明有鈣結(jié)節(jié)形成（見(jiàn)圖1D）。

2.2 外泌體的鑒定：透射電鏡下外泌體形態(tài)為杯狀或球形（見(jiàn)圖2A）。直徑大小分布在0～200nm，粒徑峰值為50nm，平均直徑為（75.5±1.4）nm，濃度為（1.57±0.09）×1 010/ml（見(jiàn)圖2B）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，外泌體標(biāo)志蛋白TSG101、Alix、CD9均表達(dá)陽(yáng)性（見(jiàn)圖2C）。結(jié)果表明這些納米顆粒為外泌體。

2.3 BMSCs來(lái)源的外泌體促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖：CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，在培養(yǎng)3、5、7d時(shí)，經(jīng)過(guò)與BMSCs來(lái)源的外泌體共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞增殖活性顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 BMSCs來(lái)源的外泌體促進(jìn)HaCaT細(xì)胞遷移與侵襲：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，HaCaT細(xì)胞經(jīng)過(guò)與BMSCs來(lái)源的外泌體共培養(yǎng)后，細(xì)胞的劃痕愈合率及細(xì)胞侵襲數(shù)目較對(duì)照組顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4～5。

2.5 BMSCs來(lái)源的外泌體促進(jìn)小鼠燒傷創(chuàng)面愈合：各組小鼠燒傷創(chuàng)面愈合率檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)BMSCs來(lái)源的外泌體處理的小鼠，在第3、7、14、21、28天，創(chuàng)面愈合率較對(duì)照組均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖6。

2.6 BMSCs來(lái)源的外泌體減輕小鼠燒傷組織損傷程度：HE染色結(jié)果顯示，在燒傷后第7天，對(duì)照組皮膚組織壞死，纖維組織大量增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)十分明顯，而外泌體組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少且分布較為均勻，有新肉芽組織形成;燒傷后第14天，對(duì)照組有新肉芽組織形成，并伴隨炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，外泌體組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)輕微，上皮組織增生明顯;燒傷后第21天，對(duì)照組上皮組織增生，炎癥反應(yīng)較輕，外泌體組纖維組織增生較少，可見(jiàn)組織再生;燒傷后第28天對(duì)照組纖維組織增生較少，外泌體組皮膚壞死明顯恢復(fù)，組織結(jié)構(gòu)較為完整。見(jiàn)圖7。

2.7 BMSCs來(lái)源的外泌體調(diào)控炎性因子表達(dá)：ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，外泌體組小鼠創(chuàng)面組織中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量均顯著降低，而抗炎因子IL-10的含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.8 BMSCs來(lái)源的外泌體對(duì)Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)的影響：免疫組化染色結(jié)果顯示，對(duì)照組創(chuàng)面組織中Ⅰ型膠原表達(dá)較外泌體組創(chuàng)面組織中Ⅰ型膠原表達(dá)更為明顯，而外泌體組中的Ⅲ型膠原較對(duì)照組中的Ⅲ型膠原表達(dá)更為明顯（見(jiàn)圖8）。

3? 討論

燒傷形成的創(chuàng)面一直被認(rèn)為是最具有破壞力的創(chuàng)傷形式之一，通常會(huì)導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生，例如繼發(fā)性炎癥反應(yīng)、組織器官衰竭和燒傷引起的一些長(zhǎng)期后遺癥等[3]。雖然在過(guò)去的幾十年中，由于治療手段的不斷改善，燒傷患者的生存率得到了提高，但仍然存在許多挑戰(zhàn)，例如燒傷后患者出現(xiàn)的功能障礙，無(wú)法實(shí)現(xiàn)功能全面的皮膚再生以及重度燒傷患者因燒傷瘢痕嚴(yán)重產(chǎn)生心理疾病[8]。細(xì)胞療法是皮膚燒傷損傷后形態(tài)重建和功能恢復(fù)最有前途的方法之一。在不同臨床條件下優(yōu)化修復(fù)過(guò)程和組織再生的細(xì)胞群體取決于多種因素，例如細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、受損組織和患者的免疫反應(yīng)等[9]。識(shí)別具有巨大治療潛力的豐富細(xì)胞來(lái)源特別重要，干細(xì)胞具有自我更新和分化為多種細(xì)胞類(lèi)型的潛力[7]，這使得運(yùn)用干細(xì)胞再生受損的組織和器官對(duì)各種病癥的治療引起了廣泛的關(guān)注。目前，干細(xì)胞作為促進(jìn)皮膚再生的手段在傷口愈合領(lǐng)域的運(yùn)用也引起了研究者們較大的興趣。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，BMSCs參與了癌癥微環(huán)境的形成，其在腫瘤進(jìn)展中的潛在作用是通過(guò)分泌的旁分泌因子所介導(dǎo)的[10]。外泌體是直徑大小40～150nm的細(xì)胞外膜囊泡，廣泛存在于所有生物流體中，包括血漿、尿液、唾液、母乳以及支氣管肺泡灌洗液，當(dāng)多囊泡體與質(zhì)膜融合時(shí)，外泌體就會(huì)釋放到細(xì)胞外環(huán)境中去[11]。外泌體作為一種旁分泌因子，外泌體可以參與生物化學(xué)物質(zhì)的運(yùn)輸，例如細(xì)胞因子、mRNA、非編碼RNA以及蛋白質(zhì)[12]，可通過(guò)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移在細(xì)胞遺傳信息交換中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。因此，外泌體在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和組織修復(fù)中也起到了關(guān)鍵作用。郭建忠等研究表明了血清來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和表皮HaCaT細(xì)胞的遷移，這使得其對(duì)小鼠燙傷傷口的愈合也產(chǎn)生了良好的促進(jìn)作用[13]。Zhang等證明了脂肪組織衍生的干細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生外泌體激活PI3K/Akt信號(hào)通路，從而加速皮膚傷口的愈合[14]。Li等通過(guò)表明MSCs衍生的外泌體lncRNA H19通過(guò)削弱miR-152-3p介導(dǎo)的對(duì)PTEN抑制作用來(lái)預(yù)防成纖維細(xì)胞的凋亡，通過(guò)注射MSCs來(lái)源的外泌體lncRNA H19后，糖尿病足潰瘍小鼠的傷口愈合明顯加快[15]。

在本研究中，從BMSCs分離到了50～200nm的生物活性成分，經(jīng)過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)，這些顆粒中TSG101、Alix及CD9蛋白均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，結(jié)果均符合外泌體特征，由此判斷成功分離到BMSCs來(lái)源的外泌體。燒傷后變性的真皮具有通過(guò)改善周?chē)h(huán)境而恢復(fù)正常皮膚形態(tài)并促進(jìn)傷口愈合的能力。在變性真皮中的血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管新生具有重要作用，表皮細(xì)胞在表皮修復(fù)中通過(guò)增殖和再上皮化發(fā)揮著關(guān)鍵作用，燒傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)上皮再形成過(guò)程開(kāi)始，這對(duì)于恢復(fù)完整的表皮屏障作用來(lái)說(shuō)至關(guān)重要[16]。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)BMSCs來(lái)源的外泌體作用于表皮細(xì)胞HaCaT后，細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移能力均明顯提高，這一結(jié)果提示HaCaT細(xì)胞行為可能與BMSCs來(lái)源的外泌體有直接關(guān)系，因此可能在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮有益作用。

燒傷后炎癥介質(zhì)在體內(nèi)釋放增加，這會(huì)引起過(guò)度的全身炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致病理變化過(guò)程中的血管通透性增加。促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-β在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和全身性炎癥中起著重要作用，他們不僅可以引起細(xì)胞因子的釋放，而且可以增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附以及嗜中性粒細(xì)胞的遷移，從而進(jìn)一步加重了器官的損傷[17-18]?？寡准?xì)胞因子IL-10具有重要免疫調(diào)節(jié)功能，能夠通過(guò)活化的巨噬細(xì)胞來(lái)抑制炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6的表達(dá)[19]。這些炎性因子的表達(dá)水平通常是燒傷治療后檢測(cè)的重要指標(biāo)之一。在本研究中，注射BMSCs來(lái)源的外泌體的燒傷小鼠皮膚組織中觀察到，創(chuàng)面組織愈合加快，組織修復(fù)較為明顯，同時(shí)TNF-α、IL-1β的含量降低而IL-10的含量升高，由此說(shuō)明，BMSCs來(lái)源的外泌體可抑制小鼠燒傷后的炎癥反應(yīng)，加快創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，BMSCs來(lái)源的外泌體可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)及促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖和遷移來(lái)促進(jìn)小鼠燒傷后創(chuàng)面愈合。但外泌體中的成分復(fù)雜，具體哪些因子發(fā)揮了有益作用以及其具體機(jī)制，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步明確。

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[收稿日期]2020-09-21

本文引用格式：唐強(qiáng)，黃志群，廖秋姣，等.BMSCs來(lái)源外泌體調(diào)節(jié)表皮HaCaT細(xì)胞及對(duì)燒傷創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（9）：1-6.