譚曉山,周 迪,李 平,李 俊,楊 蓉,陳光候,王 燕,陳大芳,龍清孟
(貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心,貴州 貴陽 550018)
山羊冷凍精液人工授精技術(shù)不僅可以減少本交帶來的疫病傳播風(fēng)險,還能減少種公羊的飼養(yǎng)數(shù)量,減少飼養(yǎng)成本及引種成本,同時提高優(yōu)秀種公羊的利用率和資源共享率,解決種羊場之間在地域及使用時間上的限制,具有良好的社會經(jīng)濟(jì)效益。山羊冷凍精液生產(chǎn)的關(guān)鍵在于稀釋液配方及冷凍保護(hù)劑。本試驗通過比較4種常用的山羊冷凍精液稀釋液配方和2種冷凍保護(hù)劑對貴州黑山羊精液品質(zhì)的影響,篩選出適合貴州黑山羊冷凍精液的稀釋液和冷凍保護(hù)劑。
1.1 試驗動物選擇體況良好、無繁殖疾病的2~4歲貴州黑山羊種公羊3~5只作為試驗動物。
1.2 試驗時間與地點2018年6月在貴州省冊亨縣冗渡鎮(zhèn)冗坪肉羊育種與繁殖工程中心及規(guī)?;】蹈咝юB(yǎng)殖示范基地進(jìn)行。
1.3 主要試劑TALP稀釋液、葡萄糖、果糖、檸檬酸鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、青霉素、鏈霉素、考馬斯亮藍(lán)、乙二醇、甘油。
1.4 主要儀器全自動精液質(zhì)量分析系統(tǒng)(德國Minitube AndroVision)、移液器(Eppendorf L23114F)、正置顯微鏡(奧林巴斯CX41)、水浴鍋(HH.S21-4)、17 ℃恒溫箱(FYL-YS-150L)、超聲波細(xì)管封口機(jī)、手提式車載運輸箱(FYL-YS-50L)、高壓滅菌鍋(LMQ.C-100E)。
1.5 山羊冷凍精液稀釋液配方根據(jù)國內(nèi)對山羊冷凍精液稀釋液配方的研究,選擇4種較理想的配方分為4組,各組選擇2種不同冷凍保護(hù)劑(見表1)。
表1 山羊凍精稀釋液配方及分組
1.6 TALP稀釋液配方 配制TALP稀釋液100 mL:NaCl 654.5 mg,KCl 20 mg,MgCl2·6H2O 10 mg,NaH2PO46.2 mg,NaHCO3210 mg,葡萄糖250 mg,丙酮酸11 mg,乳酸鈉112 mg,HEPES 120 mg。高壓滅菌,使用前加入BSA 6 mg/mL,卡那霉素 7.5 mg/mL,pH值調(diào)至7.6[5]。
1.7 方法
1.7.1 采精于上午11:00左右,氣溫22 ℃以上,通過人工采精方法采集貴州黑山羊精液,并立即進(jìn)行精子活力初步檢測,將精液移至1.5 mL試管內(nèi),用棉花覆蓋包裹進(jìn)行保溫,以減少對精子的刺激,置于17 ℃樣品運輸箱(車載冰箱)中保存帶回實驗室。
1.7.2 精液檢測檢測前先將全自動精液質(zhì)量分析系統(tǒng)打開,載物臺及載玻片等預(yù)熱至37 ℃。將精液用0.9%生理鹽水按照1∶9比例進(jìn)行稀釋后用全自動精液質(zhì)量分析系統(tǒng)檢測相關(guān)指標(biāo)。
1.7.3 冷凍精液制作方法
1.7.3.11組(1-1、1-2)與3組(3-1、3-2)按方法1:(1)將精液與 Ⅰ 液按1∶2等溫稀釋(34 ℃),用12~15層紗布包裹貯精瓶,連同 Ⅱ 液一起放入2~5 ℃冰箱中平衡1.5~2 h。(2)平衡后的精液用 Ⅱ 液等倍稀釋,并裝入0.25 mL細(xì)管后再平衡0.5~1 h。 (3)將液氮倒入完好的泡沫盒中,將細(xì)管架浸入液氮中預(yù)冷至液氮停止沸騰時提取細(xì)管架,固定于離液氮面2~3 mm的位置,將細(xì)管平放于細(xì)管架上熏蒸2~3 min后浸入液氮中保存。(4)42 ℃水浴解凍10 s后進(jìn)行檢測。
1.7.3.22組(2-1、2-2)按方法2:(1)在原精中加入3~4倍的Ⅰ液,1 200 r/min離心10 min,去掉上清液后加入Ⅰ液至原精的量。(2)將精液與Ⅰ液按1∶2等溫稀釋(34 ℃),用12~15層紗布包裹貯精瓶,連同Ⅱ液一起放入2~5 ℃冰箱中平衡1.5~2 h。(3)平衡后的精液用Ⅱ液等倍稀釋,并裝入0.25 mL細(xì)管后再平衡0.5~1 h。(4)將液氮倒入完好的泡沫盒中,將細(xì)管架浸入液氮中預(yù)冷至液氮停止沸騰時提取細(xì)管架,固定于離液氮面2~3 mm的位置,將細(xì)管平放于細(xì)管架上熏蒸2~3 min后浸入液氮中保存。(5)42 ℃水浴解凍10 s后進(jìn)行檢測。
1.7.3.34組(4-1、4-2)按方法3:(1)將精液與TALP稀釋液等量混合,離心洗滌3次,每次1 000~1 500 r/min,共5 min。(2)離心后的精液用Ⅰ液按1∶2等溫稀釋(34 ℃),用12~15層紗布包裹貯精瓶,連同Ⅱ液一起放入2~5 ℃冰箱中平衡1.5~2 h。(3)平衡后的精液用Ⅱ液等倍稀釋,并裝入0.25 mL細(xì)管后再平衡0.5~1 h。(4)將液氮倒入完好的泡沫盒中,將細(xì)管架浸入液氮中預(yù)冷至液氮停止沸騰時提取細(xì)管架,固定于離液氮面2~3 mm的位置,將細(xì)管平放于細(xì)管架上熏蒸2~3 min后浸入液氮中保存。(5)42 ℃水浴解凍10 s后進(jìn)行檢測。
2.1 精液質(zhì)量利用全自動精液質(zhì)量分析系統(tǒng)對4只貴州黑山羊種羊精液進(jìn)行檢測,由表2可見:耳號為N7003的羊精子總體活力、向前移動活力、快速前進(jìn)活力均最高,分別為91.41、59.69、47.60。其次是N7182號,分別為85.53、57.74、40.10。因此選擇這2只種羊的精液制作冷凍精液。
表2 貴州黑山羊原精液質(zhì)量檢測
2.2 不同稀釋液配方對冷凍精液質(zhì)量的影響由表3可見:(1)添加乙二醇保護(hù)劑的4組中,總體活力最高的是3-1組(67.06±10.10),其次為1-1組(58.85±5.73),2個組之間差異不顯著,均顯著高于2-1組與4-1組;前進(jìn)式活力最高的是1-1組(17.22±0.34),除與3-1組之間差異不顯著外,均顯著高于2-1組、4-1組;4個組的精子畸形率均高于20%,最高的為3-1組(29.06±16.11)。(2)添加甘油保護(hù)劑的4組中,總體活力最高的是3-2組(56.95±7.83),前進(jìn)式活力最高的是1-2組(22.73±6.25),結(jié)果與添加乙二醇保護(hù)劑的一致;精子畸形率最高的是2-2組(27.37±6.59),最低的是4-2組(15.35±4.69),但4-2組精子活力最低。(3)除2-1組外,添加乙二醇保護(hù)劑的1-1、3-1、4-1組的精子總體活力均要高于相對應(yīng)的添加甘油的1-2、2-2、4-2組,而精子畸形率則相反;同時,添加甘油保護(hù)劑的1-2、2-2、3-2組精子前進(jìn)式活力均要高于相對應(yīng)的添加乙二醇的1-1、2-1、3-1組,最高為1-2組(22.73±6.25)。
表3 不同稀釋液配方的精子質(zhì)量檢測 %
3.1添加2種不同冷凍保護(hù)劑的4種稀釋液配方對貴州黑山羊冷凍精液的影響不一,總體上是使用乙二醇保護(hù)劑的精子總體活力和畸形率高于甘油保護(hù)劑,但精子的前進(jìn)式活力低于甘油保護(hù)劑。雖然人工授精通常為深部輸精,但仍然需要精子向前移動的能力,所以甘油作為冷凍保護(hù)劑的效果要高于乙二醇。這也與他人對內(nèi)蒙古絨山羊凍精的研究結(jié)果一致[6]。因此,在貴州黑山羊凍精生產(chǎn)過程中建議選擇配方1或配方3作為稀釋液配方,甘油作為冷凍保護(hù)劑。
3.24種配方的冷凍精液精子畸形率大部分都高于20%,不符合國家標(biāo)準(zhǔn)《山羊冷凍精液》(GB 20557—2006)的要求,有可能是在推片過程中操作不當(dāng)所致。
綜合評價,在貴州黑山羊凍精生產(chǎn)過程中可選擇配方1或配方3作為冷凍精液稀釋液配方,甘油作為冷凍保護(hù)劑。