響應面法優(yōu)化桑葉黃酮的提取工藝及提取物抗氧化性能的研究

■張心壯 劉 宇 芒 來

（內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古自治區(qū)馬屬動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，農業(yè)農村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學觀測實驗站，內蒙古農業(yè)大學馬屬動物研究中心，內蒙古呼和浩特 010018）

畜禽健康是維持畜牧業(yè)持續(xù)平穩(wěn)發(fā)展的必要保證，動物體內自由基穩(wěn)態(tài)失衡是氧化應激-炎癥反應-免疫功能失衡，導致畜禽發(fā)病、降低生產性能的根本原因。氧化應激會導致細胞損傷進而衰老并逐步凋亡，激活促炎因子釋放引起炎癥反應，導致機體蛋白質、核酸、脂質等生物大分子的物質結構以及生理功能發(fā)生變化，引起動物機體代謝發(fā)生異常、生長發(fā)育受到抑制以及抗病能力降低，進而降低畜禽生產性能和畜產品品質[1]。生產中可以通過營養(yǎng)調控手段，如在畜禽飼糧中添加抗氧化劑等，改善氧化平衡狀態(tài)，緩解氧化應激損傷[2]。

桑葉自古至今作為一種中草藥，富含黃酮、生物堿、多糖等天然活性成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等藥理作用[3]。大量研究表明桑葉黃酮對氧化劑和自由基具有較強的清除能力[4-6]。Zhang 等[7]前期的研究結果表明桑葉提取物能夠通過提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的含量提高牛肉的抗氧化性能，延長貨架期，這可能與桑葉黃酮有著密不可分的關系。桑葉黃酮是經過一系列工藝從桑葉中提取的具有生物學活性的復合物[8]。但是對桑葉黃酮的提取工藝，以及桑葉提取物的抗氧化活性還缺乏系統(tǒng)的研究。響應面法（RSM）是一種統(tǒng)計方法，它使用來自適當試驗設計的定量數據來確定并同時求解多變量方程，廣泛應用于植物活性物質提取工藝的優(yōu)化[9]。本試驗以桑葉為研究對象，通過單因素試驗分析超聲波輔助、提取時間、提取溫度、料液比以及乙醇濃度對桑葉黃酮提取率的影響，利用響應面法優(yōu)化桑葉黃酮提取工藝，并對其抗氧化性能進行研究，旨在為桑葉黃酮作為天然抗氧化劑在畜禽生產中緩解氧化應激應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試驗試劑NaOH、NaNO2、Al（NO3）3、無水乙醇均為分析純，購置于國藥集團化學試劑北京有限公司；DPPH、蘆丁均為Sigma 試劑標準品。電子天平（ME-204，瑞士METTLER TOLEDO 有限公司）、超聲波儀器、三孔三溫數顯恒溫水浴鍋（DK-8D，常州申光儀器有限公司）、Epoch 全波長酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

采集新鮮桑葉，65 ℃烘干制備桑葉粉，過80 目篩，干燥貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單因素對桑葉黃酮提取率的影響

①超聲波輔助提取：準確5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照料液比1∶30 (g/mL)、乙醇濃度60%、60 ℃溫度條件下分別進行15、20、25 min的恒溫提取和超聲波輔助提取，提取后分別取200 μL提取液，測定黃酮提取率。

②乙醇濃度：準確稱取5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照提取溫度60 ℃、料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度40%、50%、60%、70%和80%，超聲波輔助提取20 min，分別取200 μL提取液，測定黃酮提取率。

③提取溫度：準確稱取5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照乙醇濃度60%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度40、50、60、70、80 ℃，超聲波輔助提取20 min，分別取200 μL提取液，測定黃酮提取率。

④提取時間：準確稱取5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照乙醇濃度60%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度60 ℃、超聲波輔助提取10、15、20、25、30 min，分別取200 μL提取液，測定黃酮提取率。

⑤料液比：準確稱取5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照乙醇濃度60%、提取溫度60 ℃、料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g/mL），超聲波輔助提取20 min，分別取200 μL提取液，測定黃酮提取率。

1.2.3 響應面優(yōu)化桑葉提取物的因素與水平

使用Design-Expert 7.1.3 設計響應面試驗方案，根據單因素試驗選擇桑葉黃酮提取率較高的4 個單因素對應的參數作為優(yōu)化桑葉黃酮提取工藝的水平零點如表1所示，分別為乙醇濃度60%、溫度60 ℃、提取時間20 min、料液比1∶30（g/mL），系統(tǒng)生成29 個試驗處理。

表1 桑葉提取試驗的因素和水平

1.2.4 標準曲線的繪制

參考付麗紅等[10]方法建立黃酮提取率測試的蘆丁標準曲線：準確吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mL 蘆丁標準品原液置于1.5 mL 的離心管中，再分別補加0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0 mL的95%乙醇溶液，封蓋混勻，得到不同濃度的蘆丁標準溶液。分別吸取200 μL 放在新的離心管中，加入20% NaNO2溶液30 μL，充分混勻后反應3 min，加入40% Al（NO3）3溶液40 μL，充分混勻后反應3 min，最后加入20% NaOH溶液100 μL，充分混勻后反應10 min。每個樣品各取200 μL，加入到96 孔板上，記好每個孔中蘆丁原液的濃度，放入全自動酶標儀中，設置波長為510 nm，測得吸光度值。得到線性回歸方程為y=2.476x-0.004，R2=0.988。

1.2.5 黃酮提取率的檢測

準確吸取200 μL 提取液于1.5 mL 刻度離心管中，按照標準曲線的步驟測定樣品中黃酮濃度，并根據以下公式計算桑葉黃酮提取率。

得率（mg/g）=C×N×V/M

式中：C——測定液總黃酮提取率（mg/mL）；

N——稀釋倍數；

V——樣品體積（mL）；

M——原料質量（g）。

1.2.6 桑葉提取物DPPH自由基清除活性的測定

參考Pereira等[11]的方法進行改進，按照中心組合試驗設計向29支離心管加入2 mL不同提取條件的桑葉提取物，然后分別加入濃度3×10-4mol/L DPPH 溶液2.0 mL，混合搖勻，反應30 min后在517 nm處測定其吸光度A1。以2.0 mL 無水乙醇代替DPPH 的吸光度為A2，以2.0 mL的純化水代替樣品溶液的吸光度為A0，以無水乙醇作為參比液。DPPH 自由基清除活性可用以下公式表示。

SA（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.3 統(tǒng)計方法

所有試驗均重復3 次，試驗結果使用SAS 9.2 統(tǒng)計軟件中GLM模型對桑葉黃酮提取率進行單因素方差分析，Duncan’s 法多重比較。Design-Expert 7.1.3建立桑葉黃酮提取率和DPPH 自由基清除活性的響應面模型，并分析其響應面結果。P<0.05表示差異顯著，0.050.1表示差異不顯著。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗對桑葉提取物黃酮提取率的影響(見圖1～圖5)

圖1 超聲波輔助與恒溫提取桑葉黃酮提取率的比較

圖2 乙醇濃度對桑葉提取物黃酮提取率的影響

圖3 提取溫度對桑葉提取物黃酮提取率的影響

圖4 提取時間對桑葉提取物黃酮提取率的影響

圖5 料液比對桑葉提取物黃酮提取率的影響

由圖1 可知，隨著提取時間的延長，超聲波輔助提取與恒溫提取所得黃酮提取率呈現先上升后降低的趨勢，且都在20 min 的時間點達到最高值，且超聲波輔助提取所得提取物的黃酮提取率高于恒溫提取所得黃酮提取率。

由圖2可知，隨乙醇濃度的升高，黃酮提取率呈現先升高后降低的趨勢，在乙醇濃度為60%時，黃酮提取率達到最高。譚春遠等[12]研究同樣發(fā)現特納草黃酮的提取率隨著乙醇濃度升高出現先增加后降低的趨勢。

由圖3 可知，隨提取溫度的升高，黃酮提取率呈現先升高后降低的趨勢，在提取溫度為60 ℃時，黃酮提取率達到最高為3.02%。溫度升高，分子的運動速率加快，有利于黃酮的溶解與溶出，可以增加提取率；但當溫度繼續(xù)升高，會降低溶劑密度，從而降低產率，而且過高的溫度可能會導致部分黃酮類化合物降解，使得提取率降低[13]。

由圖4 可知，隨提取時間的延長，黃酮提取率呈現先升高后降低的趨勢，在提取時間為20 min 時，黃酮提取率達到最高為2.91%。

由圖5 可知，隨料液比的降低，黃酮提取率呈現先升高后降低的趨勢，在料液比為1∶30（g/mL）時，黃酮提取率達到最高為2.82%?？赡苁怯捎谠谳^高的料液比下，萃取過程中溶劑很快達到飽和，較低的料液比條件下，進入細胞的溶劑較多，滲透到溶劑中的化合物較多，黃酮提取更加徹底，但是當料液比太低的時候，可能會削弱超聲波的輔助作用，影響總黃酮的溶出，反而使得總黃酮提取率下降。黃瓊等[14]在洛神花總黃酮提取工藝中的研究同樣發(fā)現隨著液固比的升高，黃酮提取率出現先升高后降低的變化。

2.2 響應面法優(yōu)化桑葉提取物黃酮提取工藝（見表2）

由表2 可知，中心試驗設計共進行29 組試驗，為減少誤差零點共測定5 次，其中黃酮提取率最低為1.63%，最高為3.42%。

表2 桑葉提取試驗設計與試驗結果

2.3 桑葉提取物黃酮提取率響應面回歸模型的擬合程度（見表3）

由表3 可知提取因素對桑葉黃酮提取率的響應面模型顯著（P<0.05），說明自變量與因變量與響應面模型擬合程度良好，其中時間和料液比因素的交互項顯著影響桑葉黃酮提取率（P<0.05），時間因素的二次項極顯著影響桑葉黃酮提取率（P<0.01），其他的交互項對黃酮的提取率沒有顯著影響（P>0.05）。

2.4 雙因素交互項對桑葉提取物黃酮提取率的影響（見圖6～圖11）

三維響應面圖和等高線圖解釋了黃酮提取率與所涉及的4 個提取參數之間的關系。在交互項對桑葉黃酮提取率的影響中，時間與料液比之間交互作用明顯，表現為曲線最陡，響應值變化較大（圖6）；溫度和料液比之間交互有一定的效應，曲線有一定坡度（圖7）；乙醇濃度與料液比（圖8）、溫度和時間（圖9）、乙醇濃度與溫度（圖10）以及乙醇濃度與時間（圖11）的交互作用較小，曲線較為平滑，響應值變化較小，結果與表3模型分析結果相吻合。

圖6 料液比與提取時間對桑葉黃酮提取率的影響

圖7 溫度與料液比對桑葉黃酮提取率的影響

圖8 乙醇濃度與料液比對桑葉黃酮提取率的影響

圖9 時間與溫度對桑葉黃酮提取率的影響

圖10 溫度與乙醇濃度對桑葉黃酮提取率的影響

圖11 時間與乙醇濃度對桑葉黃酮提取率的影響

表3 桑葉提取物黃酮提取率回歸模型的方差分析結果

2.5 桑葉提取物DPPH自由基清除活性（見表4）

由表4 可知，在3×10-4mol/L DPPH 濃度下，第17試驗組的DPPH 自由基清除活性最高，為99.09%；第14 試驗組最低，為43.13%。DPPH 自由基清除活性可以良好地體現樣品的抗氧化性能，DPPH 自由基清除活性隨著料液比的減少呈現先增高后降低的趨勢。DPPH 自由基清除活性隨著乙醇濃度增加呈現先增高后降低的趨勢，與Radojkovic 等[15]的研究有相同的結果。在Prasad 等[16]的研究認為更高的乙醇濃度可以使蛋白質被凝固，和一些脂質化合物也可能被提取，所以過高的乙醇濃度可能會降低抗氧化分子得率的降低，造成DPPH自由基清除活性在升高的情況下降低。DPPH自由基清除活性隨著提取溫度增加呈現先增高后降低的趨勢。DPPH自由基清除活性隨著提取時間增加同樣呈現先增高后降低的趨勢。提取時間的增長增加了植物與溶劑的接觸時間，能夠讓抗氧化分子更高效率地從植物內部釋放到溶劑中，增加提取物的抗氧化性能，但是過長時間的高溫環(huán)境，會影響植物細胞膜上受體蛋白的變性，降低其通透性，減少分子進出細胞膜的效率，導致溶劑中抗氧化分子含量的降低、DPPH自由基清除活性的降低[17]。

表4 桑葉提取物DPPH自由基清除活性的試驗結果

2.6 響應面試驗模型的驗證

響應面模型優(yōu)化桑葉黃酮提取條件為乙醇濃度54.75%、提取時間17.61 min、料液比1∶30.24（g/mL）、提取溫度50.27 ℃時桑樹黃酮最高得率為3.64%。選擇提取時間17 min、提取溫度為50 ℃、料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度55%條件進行驗證，結果黃酮提取率為3.62%、提取物DPPH 自由基清除活性為99.12%，黃酮提取率與理論值相對偏差為0.55%。

3結論

超聲波輔助能夠有效的提高桑葉黃酮提取率，乙醇濃度、提取時間、料液比和提取溫度均影響桑葉黃酮的提取率。響應面模型優(yōu)化的提取條件為乙醇濃度54.75%、提取時間17.61 min、料液比1∶30.24（g/mL）和溫度50.27 ℃，此條件下桑葉黃酮的提取率最高，為3.64%?？紤]到生產的實用性和方便性，選擇提取條件為，時間17 min、溫度50 ℃、料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度55%，此條件下桑葉黃酮提取率為3.62%、提取物DPPH自由基清除活性為99.12%，與理論桑葉黃酮提取率相對偏差為0.55%，可以作為桑葉黃酮作為抗氧化劑開發(fā)利用的提取工藝。