UPLC-MS/MS檢測肉制品中16 種雜環(huán)胺 前處理方法篩選

丁曉倩，惠 騰，白 雪，王振宇，張德權(quán)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

高溫是肉制品加工的主要手段之一，有助于有益物質(zhì)的形成，提高肉品風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)，但是也會產(chǎn)生一系列的致癌、致突變化合物——雜環(huán)胺（heterocyclic amines，HAs）[1-2]。HAs是一類具有雜環(huán)結(jié)構(gòu)的聚類化合物，除1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（1-methyl-9Hpyrido[3,4-b]indole，Harman）、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（9H-pyrido[3,4-b]indole，Norharman）和3,4-環(huán)戊烯吡啶并[3,2-a]咔唑（3,4-cyclopentenopyrido[3,2-a]carbazole，Lys-P-1）外，其余HAs的雜環(huán)結(jié)構(gòu)均由2～5 個含氮芳香環(huán)組成[3]。HAs在代謝過程中環(huán)外氨基經(jīng)酶催化形成N-羥基衍生物，并能進一步與DNA共價結(jié)合形成加合物，使細胞突變?yōu)槟[瘤細胞[4]，最常見的有結(jié)腸癌、肝癌、口腔癌、造血系統(tǒng)癌、乳腺癌和淋巴系統(tǒng)癌等[5-6]。根據(jù)生成條件及化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可將HAs分為兩類：第1類由葡萄糖、氨基酸、肌酸/肌酸酐在150～200 ℃經(jīng)Maillard反應(yīng)產(chǎn)生，稱為氨基咪唑氮雜芳烴類（aminoimidazoleazaarenes，AIAs），根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，AIAs類HAs又可分為喹啉類（2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹啉（2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline，IQ））、喹喔類（2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，MeIQx）、 2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,4,8-trimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，4,8-DiMeIQx）、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,7,8-trimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，7,8-DiMeIQx））、吡啶類（2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine，PhIP）；第2類由氨基酸或蛋白質(zhì)在250 ℃以上的高溫條件下，如由色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、鳥氨酸及酪蛋白或大豆蛋白熱解產(chǎn)生[7]，稱為氨基咔啉，包括α-咔琳（2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole，AαC）、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole，MeAαC））、β-咔啉（Norharman、Harman）、γ-咔啉（3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚（3-amino-1,4-dimethyl-5Hpyrido[4,3-b]indole，Trp-P-1）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶[4,3-b]吲哚（3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole，Trp-P-2））和ζ-咔啉（2-氨基-6-甲基二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d]咪唑（2-amino-6-methyldipyrido[1,2-a:3’,2’-d]imidazole，Glu-P-1）、2-氨基-二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d]咪唑（2-aminodipyrido[1,2-a:3’,2’-d]imidazole，Glu-P-2））[2,8]。人類接觸HAs的方式多是經(jīng)由飲食攝入，流行病學(xué)研究表明，長期食用HAs含量較高的肉制品與患不同癌癥之間有直接的相關(guān)性[9-10]，然而不同食物之間HAs含量有很大差異性。例如，在不同的烹飪條件下，豬肉中PhIP的含量范圍為1～320 ng/g， 而7,8-DiMeIQx的含量低于0.1 ng/g[11]。Oz等[12]發(fā)現(xiàn)鵝肉中HAs的含量也有所差異，含量最多的是IQ，其次是MeAαC、MeIQ和7,8-DiMeIQx，然而IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx和AαC的含量低于1 ng/g。最近有研究表明，人體攝入PhIP、DiMeIQx與患結(jié)直腸癌的風(fēng)險呈正比[13]。因此精確量化各種肉制品中HAs的含量尤為重要。

肉制品中HAs的含量單位僅為ng/g[14]。因此，有效、簡單的樣品制備程序?qū)⒋蟠筇岣邇x器分析的準(zhǔn)確性，可以通過液液萃取、固相萃取（solid phase extraction，SPE）、超臨界流體萃取、加壓溶劑萃取微波輔助萃取等方法實現(xiàn)[15]。最常用的是SPE法，目前為止，已經(jīng)報道了幾種改進的SPE法。Gross[16]發(fā)明了一種固相串聯(lián)法（Extrelut-PRS-C18），提高了凈化效果。這一過程通常是用NaOH溶液對樣品進行均質(zhì)，然后，用二氯甲烷從堿化的樣品中提取HAs，接著用串聯(lián)固相萃取小柱（Extrelut、丙基磺酸陽離子固相萃取柱和C18小柱）對目標(biāo)分析物進行純化。作為一種傳統(tǒng)的方法，該方法近年來已經(jīng)被大量研究報道，然而該方法耗時較長，在實際應(yīng)用中并不方便。隨后研究者發(fā)明了更方便、更易于使用的方法。使用Oasis MCX固相萃取柱代替PRS和C18固相萃取柱，MCX固相萃取柱中的混合模式材料中含有共聚物和硅膠顆粒，這些物質(zhì)具有疏水和離子相互交換作用，能夠?qū)崿F(xiàn)一步從樣品中提取HAs。近年來，QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe）法也作為一種快速、簡便、便宜、有效且安全的提取方法用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）-二極管陣列檢測或HPLC-電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）-質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）測定肉制品中的HAs[17-20]。

LC-MS/MS具有選擇性高、靈敏度高、無需衍生化處理等優(yōu)點，被證實是一種較理想的分析方法[21]，能夠?qū)崿F(xiàn)肉類中痕量HAs的測定。因此本實驗以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測方法為基礎(chǔ)，比較分析串聯(lián)固相萃取法（Extrelut-PRS-C18、PRS-C18固相萃取柱萃取法）、MCX固相萃取柱萃取法以及分散固相萃取法（QuEChERS）3 類4 種方法對肉制品中HAs提取效果的影響，以此為基礎(chǔ)建立一種高效、安全、經(jīng)濟的肉制品中HAs的UPLCMS/MS檢測方法，以期為后續(xù)肉制品中HAs提取檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 只小尾寒羊與蒙古羊雜交的二寒羊公羊前腿，購自內(nèi)蒙古巴彥淖爾草原宏寶公司，二寒羊公羊來自于集中飼養(yǎng)，屠宰平均月齡5 個月，體質(zhì)量30 kg左右。在（6.0±2.0）℃、相對濕度（95±5）%條件下排酸24 h，羊前腿肉半膜肌pH 6.2±0.3。4 ℃條件下立即將上述6 條羊前腿去皮去骨修掉可見的結(jié)締組織，收集肌肉組織貯存于－30 ℃?zhèn)溆谩?/p>

16 種HAs標(biāo)準(zhǔn)品：PhIP、IQ、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoxaline，IQx）、2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉（2-amino-3,4-dimethylimidazo[4,5-f]quinoline，MeIQ）、MeIQx、7,8-DiMeIQx、4,8-DiMeIQx、2-氨基-4,7,8-三甲基咪唑并[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-4,7,8-trimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline，4,7,8-TriMeIQx）、AαC、MeAαC、Glu-P-1、Glu-P-2、Trp-P-1、Trp-P-2、Harman和Norharman（每種化合物純度均大于99%） 加拿大TRC公司；甲醇、乙腈（均為色譜級） 美國 賽默飛世爾公司；冰乙酸、乙酸銨（均為色譜級） 上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸、乙酸（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Bond Elut C18固相萃取柱（500 mg/3 mL）、Bond Elut PRS固相萃取柱（500 mg/3 mL）、Bond Elut QuEChERS萃取包、Bond Elut QuEChERS dSPE試劑盒 美國安捷倫公司；Extrelut NT20空柱（PE柱，20 mL）及填充料硅藻土 德國Merck公司；Oasis MCX 3 mL Vac Cartridge, 60 mg Sorbent per Cartridge, 30 μm Particle Size 美國Waters 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

6470 LC/TQ LC-MS/MS儀 美國安捷倫公司；ML204-02電子天平 上海梅特勒-托利多有限公司；Testo 205 pH計 德國德圖公司；CR22G II高速冷凍離心機 日本日立公司；TTL-DCII氮吹儀 北京同泰科技有限公司；Ultra Turrax Disperser S25勻漿器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

羊前腿肉在室溫下解凍2 h，去掉可見的筋膜和脂肪，切成小塊后用絞肉機攪碎成肉糜。稱取30 g肉糜制成直徑6 cm、厚1 cm的圓形肉餅。將肉餅在500～600 ℃條件下炭火烤制10 min，直至肉餅的中心溫度達到72 ℃左右，炭火與肉之間的距離為10 cm。將烤制好的肉餅置于－20 ℃?zhèn)溆?，每個樣品3 個重復(fù)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取16 種HAs標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg溶于甲醇中，并定容至50 mL，得16 種100 μg/mL各HAs標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再吸取各種HAs儲備液制成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、50、100、200 ng/mL和500 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 HAs提取方法

采用串聯(lián)固相萃取法（Extrelut-PRS-C18、 PRS-C18）[16,22-23]、MCX固相萃取柱萃取法[2]和分散固相萃取法（QuEChERS法）[24]3 類4 種方法對肉制品中HAs進行提取。

1.3.3.1 Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法

稱取2.0 g攪碎后的炭烤羊肉與12 mL 1 mol/L NaOH溶液混合，將攪拌好的勻漿物與10 g硅藻土充分混勻后，將其填充到Extrelut NT20空柱中。首先將PRS柱活化（用5 mL含5%甲苯的二氯甲烷），用60 mL含5%甲苯的二氯甲烷將HAs從Extrelut NT20柱洗脫到預(yù)先活化的PRS柱中，使洗脫液完全通過PRS柱。然后依次用6 mL 0.01 mol/L鹽酸、15 mL甲醇-0.3 mol/L鹽酸（1∶1，V/V）、2 mL水洗脫PRS柱。將洗脫液收集于100 mL離心管中，加入0.5 mL濃氨水，然后用25 mL蒸餾水稀釋混勻（該步驟得到非極性HAs）。將該混合液通過500 mg C18柱（預(yù)先用5 mL甲醇和10 mL水活化），再用2 mL水沖洗C18柱；用20 mL 0.5 mol/L醋酸銨溶液（pH 8.2）再次洗脫PRS柱得到極性HAs混合液，將混合液通過500 mg C18柱（預(yù)先用5 mL甲醇和10 mL水活化），再以2 mL水淋洗去除雜質(zhì)。兩部分C18柱中的HAs分別用1 mL甲醇-氨水（9∶1，V/V）混合液洗脫，將兩部分洗脫液收集并混合，過0.22 μm的濾膜，濾液有待分析。

1.3.3.2 PRS-C18固相萃取柱萃取法

稱取2.0 g攪碎后的炭烤羊肉與10 mL乙酸乙酯和2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液混合，渦旋振蕩3 min，5 000×g離心5 min，取上清液放入50 mL離心管中，用同樣的方法再提取2 次，將上清液混合。除去離心管底部的水，將乙酸乙酯提取物氮吹吹干，用6 mL二氯甲烷（一次2 mL，共3 次）復(fù)溶。用5 mL二氯甲烷對PRS柱進行活化，將復(fù)溶液添加到PRS柱中，分別用6 mL 0.1 mol/L HCl溶液、15 mL甲醇-0.1 mol/L HCl（50∶50，V/V）混合液、2 mL蒸餾水洗脫PRS柱，收集洗脫液于100 mL的離心管中得到非極性HAs，再用0.5 mL氨水中和洗脫液，添加到預(yù)先用2 mL甲醇和5 mL水活化的C18柱中；用20 mL 0.5 mol/L醋酸銨溶液（pH 8.5）再次洗脫PRS柱，得到極性HAs，添加到預(yù)先用2 mL甲醇和5 mL水活化的500 mg C18柱中。最后分別用1 mL甲醇-氨水（9∶1，V/V）混合液洗脫2 個C18柱，將兩部分洗脫液收集并混合，過0.22 μm的濾膜，濾液有待分析。

1.3.3.3 MCX固相萃取柱萃取法

稱取3.0 g攪碎后的炭烤羊肉與30 mL 1 mol/L NaOH溶液混合，振蕩1 min。將該堿性溶液與13 g硅藻土混合，添加50 mL乙酸乙酯并超聲萃取30 min，重復(fù)2 次萃取，收集上清液。該液于4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液。將上清液（10 mL）乙酸乙酯層通過預(yù)先分別用6 mL甲醇、蒸餾水和0.1 mol/L鹽酸活化的MCX柱子中。然后依次用鹽酸（6 mL、0.1 mol/L）和甲醇（6 mL）沖洗MCX柱子。用6 mL氨化甲醇（甲醇-氨水（19∶1，V/V））對小柱填料中吸附的HAs進行洗脫。采用氮吹儀將收集HAs的氨化甲醇洗脫液吹干，添加1.0 mL甲醇復(fù)溶。采用0.22 μm有機針頭式濾器過濾，將過濾后的復(fù)溶液于－20 ℃條件下密封保存，待進樣。

1.3.3.4 QuEChERS法

稱取2.0 g攪碎后的炭烤羊肉裝入50 mL離心管中，放入1 塊陶瓷均質(zhì)石和10 mL去離子水，振蕩20 min，加入10 mL含有1%醋酸的乙腈混合液，再次振蕩15 min。加入萃取粉包（包括4 g無水硫酸鎂和1 g無水醋酸鈉），振蕩1 min，然后在4 ℃、3 200×g離心10 min。取上清液6 mL加入凈化用粉末管中，其中含有900 mg無水硫酸鎂、300 mgN-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）和300 mg C18EC（封端的反相十八硅烷硅膠顆粒），1 000 r/min均質(zhì)1 min，4 ℃、3 200×g離心5 min，取1 mL上清液用氮吹儀吹干，加入1.0 mL甲醇溶液，渦旋振蕩，使樣品溶解，將溶液通過0.22 μm的PVDF濾膜過濾，最后進行UPLC-MS/MS分析。

1.3.4 檢測條件

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：Orbax SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，80 ?（PN∶ 822700-902），安捷倫公司）；流速0.300 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。流動相體系： A為10 mmol/L乙酸-乙酸銨緩沖液（pH 2.9），B為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 16 種HAs分離的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for separation of 16 HAs

1.3.4.2 質(zhì)譜檢測條件

電離方式：ESI+；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測；監(jiān)測離子參數(shù)見表2。

表2 16 種HAs特征離子質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrpmetric parameters for 16 HAs

續(xù)表2

1.3.5 HAs前處理的方法學(xué)考察

本研究對4 種前處理方法的MS/MS檢測方法線性范圍、檢出限（limits of detection，LOD）、定量限（limits of quantification，LOQ）、加標(biāo)回收率、精密度等方法學(xué)參數(shù)進行分析。HAs加標(biāo)回收率：在炭烤肉餅中添加10、50、100 ng/g 3 個添加量的HAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)方法檢測分析，計算回收率和精密度。分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比為該方法對各種HAs的LOD和LOQ。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)并繪制表格，指標(biāo)均為3 次平行測定結(jié)果，結(jié)果用平均值表示。利用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，并進行Duncan法多重比較，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)評價

2.1.1 線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)

采用1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)方法對肉制品中的HAs進行提取和檢測分析。以各種HAs質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程和相關(guān)系數(shù)見 表3。結(jié)果表示，該檢測方法中16 種HAs的R2均大于0.999，16 種HAs在1～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以滿足定量分析的需要。

表3 16 種HAs的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear ranges, calibration curve equations, and correlation coefficients for 16 HAs

2.1.2 LOD和LOQ測定結(jié)果

由表4可以看出，在4 種不同的前處理方法中，16 種HAs的LOD和LOQ差異顯著（P＜0.05）。Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法中16 種HAs的LOD為0.03～0.50 ng/g，LOQ為0.11～1.66 ng/g；PRS-C18固相萃取柱萃取法中16 種HAs的LOD為0.04～0.60 ng/g，LOQ為0.15～2.01 ng/g；MCX固相萃取柱萃取法中16 種HAs的LOD為0.01～0.50 ng/g，LOQ為0.03～1.67 ng/g； QuEChERS法中16 種HAs的LOD為0.01～0.32 ng/g，LOQ為0.04～1.05 ng/g。對于LOD，MCX固相萃取柱萃取法中7,8-DiMeIQx的LOD為0.02 ng/g，顯著低于（P＜0.05）其他3 種方法；QuEChERS法中，IQx、Trp-P-2、MeAαC的LOD顯著低于（P＜0.05）其他3 種方法；在MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法中，MeIQ、7,8-DiMeIQx、Harman和AαC的LOD顯著低于其余2 種方法 （P＜0.05）。對于LOQ，在MCX法中，4,7,8-TriMeIQx的LOQ為0.03 ng/g，顯著低于其他3 種方法（P＜0.05）；在MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法中，MeIQ、7,8-DiMeIQx、Harman、PhIP、AαC、Trp-P-2的LOQ顯著低于其他3 種方法（P＜0.05）。綜上所述，MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法的LOD和LOQ較低。

表4 16 種HAs的LOD和LOQTable 4 LODs and LOQs for 16 HAs ng/g

2.1.3 回收率和精密度實驗結(jié)果

選用4 種不同的前處理方法對HAs進行提取，并用UPLC-MS/MS進行檢測，進行高、中、低3 個水平的加標(biāo)回收實驗，測定結(jié)果見表5。

表5 炭烤羊肉餅中16 種HAs的加標(biāo)回收率和精密度Table 5 Recoveries and precision for 16 HAs spiked in charcoal roasted mutton patties

續(xù)表5

2.1.3.1 Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法結(jié)果分析

Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法結(jié)果表明，Glu-P-1、Norharman、Harman和AαC回收率為64.31%～123.46%，其余12 種HAs的回收率較差，其中IQx回收率僅為3.14%～35.04%。前人研究結(jié)果表明，此方法中IQ型HAs回收率低于50%[25-26]。該研究方法的大量實驗數(shù)據(jù)表明，HAs回收率低的原因是提取硅藻土的提取性能較差[27]。由于所檢測的16 種HAs極性范圍寬，有極性和非極性2 種，因此要保證這16 種HAs有很高的回收率有一定的困難。萬可惠等[22]建立了固相萃取-高效液相色譜同時測定牛肉制品中IQ、MeIQ、4,8-DiMeIQx、Norharman、Harman、Trp-P-1、Trp-P-2、PhIP、AαC、MeAαC 10 種HAs的方法，結(jié)果表明，10 種HAs的加標(biāo)回收率為61.69%～101.81%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.28%～7.81%，其中Trp-P-1、Trp-P-2和IQ的回收率分別為64.91%、75.60%和83.19%。Totibio等[28]用固相萃取法從不同的凍干肉汁中提取16 種HAs，他們同樣使用Extrelut作為吸附劑，接著使用PRS和C18柱進行純化、最后使用LC-MS對HAs進行測定和定量，結(jié)果顯示16 種HAs的LOD為0.4～11.7 ng/g[28]。 Costa等[29]采用相似的方法對燒烤沙丁魚和鮭魚樣品中的14 種HAs進行檢測，其中有9 種HAs的回收率超過50%，然而Trp-P-1、Trp-P-2、AαC、MeAαC、PhIP的回收率范圍僅為23%～32%。

2.1.3.2 PRS-C18固相萃取柱萃取法結(jié)果分析

PRS-C18固相萃取柱萃取法結(jié)果表明，當(dāng)添加量為10 ng/g時，14 種HAs的回收率為25.33%～54.79%，而IQx和AαC的回收率分別為65.61%和86.11%。當(dāng)添加量為50 ng/g和100 ng/g時，15 種HAs回收率為62.23%～104.95%，GIu-P-1的回收率為54.65%～57.63%。此方法中，16 種HAs的精密度良好，為0.06%～12.26%。Janoszka等[30]對比4 種前處理方法對HAs提取效果的影響，結(jié)果表明使用硅藻土、C18和PRS柱提取HAs最為簡便，回收率分別為IQ 85%、MeIQ 50%、MeIQx 46%、4,8-DiMeIQx 62%、PhIP 50%。邵斌等[31]建立了固相萃取-高效液相色譜同時測定傳統(tǒng)禽肉制品中9 種HAs，包括IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、PhIP、Trp-P-1、Trp-P-2、Norharman、Harman，經(jīng)過條件優(yōu)化，選用乙酸乙酯進行提取，提取液經(jīng)PRS和C18固相萃取小柱凈化，3 個加標(biāo)水平的平均回收率為60.47%～90.55%（n= 6），RSD為0.49%～9.74%（n= 6），LOD為0.1～3.6 μg/kg。該方法需要高效繁瑣的預(yù)處理步驟去除肉中的干擾成分（如脂肪、無機鹽、碳水化合物和蛋白質(zhì)等），耗時長，而且在轉(zhuǎn)移過程中，容易造成萃取液損失，因此在實際應(yīng)用中不方便，尤其是在分析大樣本實驗中[32-33]。

2.1.3.3 Oasis MCX萃取方法結(jié)果分析

MCX固相萃取柱萃取法結(jié)果表明，IQ、IQx、Trp-P-1和MeAαC的回收率為34.43%～79.31%。其余12 種HAs的回收率為62.43%～100.37%，精密度為0.32%～57.94%。Yan Yan等[34]建立了基于酸提取和使用Oasis MCX固相萃取柱一步固相萃取純化的方法，對肉餅中11 種極性HAs進行提取，11 種HAs的回收率為58.2%～107.7%。然而該方法只能提高有限數(shù)量的中、強極性HAs?；诖?，Yan Yan等[35]進一步建立了一種基于乙腈萃取和Oasis MCX一步純化的新型預(yù)處理方法，測定烤肉中17 種HAs，包括11 種極性HAs和6 種非極性HAs。同時與2 種改進的Gross法進行對比，結(jié)果表明，改進的方法1用硅藻土和乙酸乙酯代替二氯甲烷和Extrelut柱，用Oasis MCX代替PRS和C18固相萃取柱。方法2與方法1類似，只是在硅藻土和堿液混合后，又進行了微波萃取。結(jié)果表明方法1的回收率為32.7%～78.5%，方法2的回收率為33.7%～74.9%，且2 種方法結(jié)果沒有顯著差異 （P＞0.05），而用乙腈提取的HAs能夠獲得更好的回收率（42.5%～99.0%）和更好的精密度（低于12.2%）。這一方法較傳統(tǒng)方法而言，在一定程度上縮短了前處理時間，但是會耗費大量的有機試劑，在一定程度上會對人體的健康造成損害。

2.1.3.4 QuEChERS法結(jié)果分析

本實驗中QuEChERS法取得良好的回收率和精密度，16 種HAs的回收率為76.66%～119.27%，精密度為0.44%～18.57%。Hsiao等[19]用QuEChERS結(jié)合HPLC-ESI-MS/MS測定豬肉酥中的20 種HAs，回收率為58.9%～117.4%，LOD為0.003～0.05 ng/g，LOQ為0.01～0.05 ng/g。同時Chang等[18]也用QuEChERS法實現(xiàn)了同步檢測食用油中20 種HAs。Jian等[36]研究了用液-液萃取結(jié)合SPE和QuEChERS法提取肉制品中11 種HAs，結(jié)果表明，QuEChERS法提供了更好的線性范圍和更高的靈敏度。Xian Yanping等[17]還使用了QuEChERS法及Fe3O4納米顆粒脫色法對咖啡產(chǎn)品中的HAs進行萃取和純化，同時結(jié)合UPLC-MS/MS對14 種HAs進行測定，結(jié)果表明，14 種HAs的日內(nèi)平均加標(biāo)回收率為81%～101%，精密度為5.0%～7.8%。

綜上所述，在4 種不同的提取方法中，QuEChERS法有較高的回收率和精密度，能夠較好地檢測肉中的16 種HAs。

2.2 前處理成本分析

由表6可知，Oasis MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法的經(jīng)濟成本低，提取一個樣品所需萃取柱成本分別約為32.01 元和69.79 元，而NT20-PRS-C18和PRS-C18固相萃取柱萃取法成本較高，是Oasis MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法的1.1～3.3 倍，采用Oasis MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法前處理提取肉制品中的HAs較為經(jīng)濟；與此同時，由表6得知，QuEChERS萃取法所花時間最少，前處理一個樣品所需時間僅為0.5 h，其余3 種前處理方法均超過1 h，特別是對于大批量處理肉制品中的HAs時，QuEChERS萃取法顯示出了較強的優(yōu)勢。

表6 制備單個樣本所需成本計算Table 6 Comparison of cost and extraction time required for preparation of a single sample using four extraction methods

3 結(jié) 論

本實驗以肉制品為實驗原料，采用串聯(lián)固相萃取法（Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法、PRS-C18固相萃取柱萃取法）、MCX固相萃取柱萃取法和分散固相萃取法（QuEChERS法）4 種前處理方法對肉制品中16 種HAs進行提取，并采用UPLC-MS/MS對提取物進行分析。結(jié)果表明：1）在Extrelut-PRS-C18固相萃取柱萃取法中，Glu-P-1、Norharman、Harman和AαC回收率為64.31%～123.46%，其余12 種HAs的回收率較差，其中IQx的回收率僅為3.14%～35.04%。16 種HAs的LOD為0.03～0.50 ng/g，LOQ為0.11～1.66 ng/g；在PRS-C18固相萃取柱萃取法中，當(dāng)添加量為10 ng/g時，14 種HAs的回收率為25.33%～54.79%，而IQx和AαC的回收率分

別為65.61%和86.11%。當(dāng)添加量為50 ng/g和100 ng/g 時，15 種HAs回收率為62.23%～104.95%，Glu-P-1的回收率為54.65%～57.63%。此方法16 種HAs的LOD為0.04～0.60 ng/g，LOQ為0.15～2.01 ng/g，精密度為0.06%～12.26%；在MCX固相萃取柱萃取法中，IQ、IQx、Trp-P-1和MeAαC的回收率為34.43%～79.31%，其余12 種HAs的回收率為62.43%～100.37%，精密度為0.32%～57.94%，LOD為0.01～0.50 ng/g，LOQ為0.03～1.67 ng/g；QuEChERS法的回收率為76.66%～115.10%，精密度為0.44%～18.57%，LOD為0.01～0.32 ng/g，LOQ為0.04～1.05 ng/g。相比較于其他3 種方法而言，QuEChERS法有更好的回收率和精密度。2）MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法提取單個HAs所需成本較低、時間較短。MCX固相萃取柱萃取法和QuEChERS法提取單個樣品所需萃取柱價格分別為32.01 元和69.79 元，所需時間分別為1.2 h和0.5 h。綜合而言，QuEChERS法具有快速、簡便、穩(wěn)固的特點，容易實現(xiàn)大樣本檢測。