三重real-time PCR同步檢測(cè)黃牛、 水牛和牦牛成分

吳 姍，張明哲，方 云，陳 哲，張 荃，孫 超，沈旭芳，虞惠貞，尹文秀，張曉峰

（浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016）

在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)下的肉制品制假販假事件屢禁不絕，已成為中國食品質(zhì)量控制面臨的重要挑戰(zhàn)之一。牛肉一直是制假摻假的重災(zāi)區(qū)，除了用價(jià)格相對(duì)低廉的豬肉、雞肉、鴨肉冒充牛肉外，更有甚者將狐貍、水貂等肉摻入牛肉中進(jìn)行銷售。此外，由于牛肉本身可分為黃牛肉、水牛肉和牦牛肉，且這3 類肉之間也存在較大的價(jià)格差異，一般來說牦牛肉價(jià)格高于黃牛肉，黃牛肉又高于水牛肉，因此往往會(huì)出現(xiàn)水牛肉、黃牛肉被用來冒充牦牛肉，而水牛肉還被用來冒充黃牛肉。

近年來，國家針對(duì)肉制品摻假問題加強(qiáng)檢測(cè)監(jiān)管力度，大力支持肉品檢測(cè)方法的研究。目前對(duì)肉類真?zhèn)舞b別的檢測(cè)技術(shù)主要包括基于蛋白的免疫技術(shù)[1-2]，基于代謝物質(zhì)的光譜技術(shù)[3-4]、電子鼻[5-6]、電子舌[7]技術(shù)，以及基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)等。由于DNA的生物學(xué)穩(wěn)定性，不論是在生肉或是熟肉，或是在成分多樣復(fù)雜的復(fù)合食品中，即便是在腐敗變質(zhì)的肉制品中，其物種特異性的DNA都能穩(wěn)定存在，因此分子生物學(xué)的鑒定方法，仍是目前比較常用和可靠的鑒定方法。

早在1998年，為了防止瘋牛病通過飼料傳播，Tartaglia等[8]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）在飼料中進(jìn)行牛源性成分的檢測(cè)。此后，在PCR基礎(chǔ)上又衍生了PCR-限制性片段長度多 態(tài)性[9-10]和PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析[11]等技術(shù)。實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）的產(chǎn)生，免去了PCR技術(shù)后續(xù)凝膠電泳的步驟，同時(shí)能對(duì)整個(gè)PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，因此該方法目前已成為一種較普及的用于肉制品真?zhèn)舞b別的方法[12-16]。目前用來鑒別牛肉真?zhèn)蔚膔eal-time PCR方法已經(jīng)較多，且建立一系列檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，如SN/T 2051—2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)PCR法》[17]，GB/T 25165—2010《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[18]、SN/T 2557—2010《畜肉食品中牛成分定性檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[19]、 SB/T 10923—2012《肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的測(cè)定 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[20]等，但上述標(biāo)準(zhǔn)并不能區(qū)分牛的種類。雖然目前也有有關(guān)黃牛[21]（參考冀德君等[22]和亐開心[23]等觀點(diǎn)，黃牛包括普通牛（Bos taurus）和瘤牛（Bos indicus））、水牛（Bubalus bubalis）[21,24]和牦牛（Bos grunniens）[21,25]的檢測(cè)方法，但上述方法存在靈敏度不高，或者覆蓋度不高，即存在不能檢測(cè)到種內(nèi)某些品種的情況。

本研究研發(fā)具有黃牛、水牛和牦牛特異性的3 組引物探針，以實(shí)現(xiàn)用三重real-time PCR方法快速同步地對(duì)上述3 種牛肉制品進(jìn)行真?zhèn)舞b別。以期為市場(chǎng)監(jiān)管部門在實(shí)施相應(yīng)監(jiān)管措施時(shí)，提供詳實(shí)可靠、可供參考的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃牛、水牛和牦牛以及其他動(dòng)植物樣本購于市場(chǎng)或者本實(shí)驗(yàn)室保存，其中貉和銀狐的樣品采集自杭州動(dòng)物園。動(dòng)物樣品取肌肉或骨骼、內(nèi)臟和血液部分；植物樣品取可食用部分。用于方法建立的黃牛、水牛和牦牛的樣本真實(shí)性通過real-time PCR檢測(cè)及測(cè)序確認(rèn)[26-27]；其余肉類樣本，包括綿羊、豬、馬、驢、狗、雞、鴨、鵝等的真實(shí)性通過相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（略）鑒定，其余樣本通過外觀確認(rèn)。

實(shí)際的深加工樣品中，如肉丸、肉松等，往往存在多種肉摻雜的情況。為了模擬檢測(cè)混合樣品，將黃牛、水牛和牦牛3 種肉干按照表1的質(zhì)量比制成混合肉樣，每個(gè)混合樣總質(zhì)量10 g，共制成9 個(gè)樣（表1， 樣品A～I(xiàn)）。混合樣品經(jīng)過振蕩研磨儀混合研磨 （5 500 r/min，20 s，重復(fù)4～6 次）成肉泥，取充分混合的樣品進(jìn)行DNA提取。

表1 黃牛、水牛和牦?；旌先鈽雍突旌螪NA樣品的制備Table 1 Preparation of mixed meat samples and mixed DNA samples from yellow cattle, buffalo and yak

Premix ExTaq大連TaKaRa公司；FF3750食品抽提試劑盒 美國Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Precellys Evolution振蕩研磨儀 法國Bertin Technologies公司；NanoDrop ND-1000紫外-可見光分光光度計(jì) 美國Thermo Scientific公司；Lightcycle 480熒光定量PCR儀 德國Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA抽提

取動(dòng)物肌肉、骨骼、內(nèi)臟、血液或者植物可食用部分100 mg或100 μL，使用FF3750食品抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取，最后抽提得到DNA溶解在20～100 μL水中，使抽提得到的DNA質(zhì)量濃度大于等于10 ng/μL。在單重、雙重和三重real-time PCR體系靈敏度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，將黃牛、水牛和牦牛抽提得到的DNA質(zhì)量濃度均調(diào)整為25 ng/μL，然后再進(jìn)行4 倍梯度稀釋。同時(shí)，還制備了3 種牛的DNA混合樣，取質(zhì)量濃度約為10 ng/μL，純度A260nm/A280nm為1.7～1.9，3 種牛的DNA樣品，按照表1體積比制成DNA混合樣，每個(gè)混合樣總體積為200 μL，共制成9 個(gè)樣（表1，樣品A′～I(xiàn)′）。DNA質(zhì)量濃度和純度用NanoDrop ND-1000紫外-可見光分光光度計(jì)在260 nm和280 nm波長處進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 引物和探針的設(shè)計(jì)

基于黃牛、牦牛線粒體12S rRNA基因（序列號(hào)分別為KF926377.1和KJ463418.1）和水牛的線粒體Cyt b基因（序列號(hào)AY488491.1），根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Express軟件設(shè)計(jì)了黃牛、水牛和牦牛特異性的引物探針3 組（表2）。

表2 檢測(cè)黃牛、牦牛和水牛的引物和探針序列Table 2 Primers and probes used for the detection of yellow cattle-, buffalo- and yak-derived components

1.3.3 real-time PCR擴(kuò)增檢測(cè)

用于內(nèi)參照引物探針的real-time PCR體系及反應(yīng)條件見標(biāo)準(zhǔn)GB/T 25165—2010[18]。

用于3 種牛檢測(cè)的單重real-time PCR反應(yīng)體系如下：10 μL Premix ExTaq，上游引物（10 pmol/μL）0.4 μL，下游引物（10 pmol/μL）0.4 μL，探針（10 pmol/μL）0.4 μL，取上述DNA液1 μL，用水補(bǔ)足體積至20 μL。應(yīng)用熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸23 s，40 個(gè)循環(huán)。

三重real-time PCR對(duì)黃牛、水牛和牦牛同步檢測(cè)時(shí)，黃牛、水牛和牦牛探針的5′端分別用FAM、HEX和ROX標(biāo)記，3′端則用Eclipse標(biāo)記。三重real-time PCR體系如下：10 μL Premix ExTaq，各引物（10 pmol/μL）均0.13 μL，各探針（10 pmol/μL）均0.27 μL，取對(duì)應(yīng)的DNA模板各1 μL，用水補(bǔ)足體積至20 μL。應(yīng)用熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸23 s，40 個(gè)循環(huán)。

FAM、ROX、HEX三重?zé)晒庋a(bǔ)償。熒光補(bǔ)償反應(yīng)程序參照Roche說明書：1）95 ℃預(yù)變性10 s；2）95 ℃變性5 s；60 ℃退火延伸23 s；40 個(gè)循環(huán)；3）95 ℃變性10 s；40 ℃退火30 s；95 ℃變性；40 ℃，1 s。補(bǔ)償反應(yīng)時(shí)進(jìn)行單重real-time PCR，體系如下：10 μL Premix ExTaq，上游、下游引物（10 pmol/μL）各0.4 μL，探針 （10 pmol/μL）0.8 μL，取DNA 1 μL，用水補(bǔ)足體積至20 μL。在三重real-time PCR結(jié)束后調(diào)用該熒光補(bǔ)償程序，進(jìn)行熒光補(bǔ)償，對(duì)補(bǔ)償后的數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷，確保無熒光干擾而產(chǎn)生的假陽性。

real-time PCR檢測(cè)中，Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，Ct值為3 次結(jié)果的平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

為確定單重real-time PCR檢測(cè)體系的檢出限和線性范圍，對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行梯度稀釋，并利用DNA濃度和Ct值之間的相關(guān)性繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將抽提得到的DNA進(jìn)行4 倍梯度稀釋，進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。變量相關(guān)性 公式[28]：Ct =blgCDNA+a（b為斜率，a為截距）。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針的特異性

將設(shè)計(jì)得到的用于檢測(cè)3 種牛的引物探針用于檢測(cè)包括黃牛、水牛和牦牛在內(nèi)的19 種家畜、家禽及其他動(dòng)植物。結(jié)果顯示上述引物探針只對(duì)目標(biāo)物種呈陽性反應(yīng)，其他非目標(biāo)物種均未檢測(cè)到Ct值（表3）；而同時(shí)用檢測(cè)真核生物的引物探針檢測(cè)時(shí)，反應(yīng)都呈陽性，說明抽提得到的DNA質(zhì)量符合real-time PCR檢測(cè)要求。在單重real-time PCR檢測(cè)體系中，以單一的目標(biāo)DNA為檢測(cè)樣本，設(shè)計(jì)得到的引物探針序列有較好的特異性。

表3 黃牛、水牛和牦牛引物探針的特異性Table 3 Specificity of the primers and probes for the detection of yellow cattle-, buffalo- and yak-derived components

2.2 單重real-time PCR的檢測(cè)靈敏度

將3 種牛DNA質(zhì)量濃度都調(diào)節(jié)到25 ng/μL左右，再進(jìn)行4 倍稀釋，共形成8 個(gè)質(zhì)量濃度梯度。各個(gè)DNA質(zhì)量濃度單重real-time PCR的結(jié)果如表4所示，當(dāng)3 種DNA質(zhì)量濃度稀釋到0.025 ng/μL時(shí)，3 種牛的檢測(cè)都能得到Ct值小于35且陽性明顯的S型擴(kuò)增曲線，此時(shí)得到3 組標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值均大于0.99（黃牛：y=－4.270 3x+26.524，R2=0.992 3；水牛：y=－4.281 1x+27.028，R2=0.995 8；牦牛：y=－4.376 4x+24.514，R2=0.997 7）；但進(jìn)一步稀釋后（質(zhì)量濃度至0.006 ng/μL），黃牛和牦牛得到的Ct值分別為38.4和38.8，而水牛則無Ct值顯示，此時(shí)黃牛和牦牛的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值分別降至0.982 6 （y=－4.683 7x+26.691）和0.959 7（y=－5.166 2x+24.833）；DNA質(zhì)量濃度降至0.002 ng/μL左右時(shí)，則3 種牛的檢測(cè)結(jié)果都呈陰性。R2值大于0.99時(shí)，說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線所取范圍內(nèi)的DNA質(zhì)量濃度與Ct值有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，Ct值能比較準(zhǔn)確地反映對(duì)應(yīng)DNA的濃度；R2值下降，說明兩者間的對(duì)應(yīng)關(guān)系下降，Ct值反應(yīng)對(duì)應(yīng)DNA質(zhì)量濃度的可信度下降。

表4 單重real-time PCR檢測(cè)黃牛、水牛和牦牛的靈敏度Table 4 Sensitivity of simplex real-time PCR for the detection of yellow cattle-, buffalo- and yak-derived components

因此，為方便統(tǒng)計(jì)，在后續(xù)3 種牛的雙重及三重real-time PCR檢測(cè)中，以35為Ct值的臨界值，3 次檢測(cè)結(jié)果中2 次或2 次以上Ct值小于35，結(jié)果為陽性（+）；2 次或2 次以上Ct值大于等于35或無Ct值顯示，結(jié)果為 陰性（－）。

2.3 雙重和三重real-time PCR的檢測(cè)靈敏度

在雙重real-time PCR的檢測(cè)中，將任意2 種引物探針組合按照1∶1比例混合，得到結(jié)果顯示：只有黃牛的檢測(cè)因?yàn)樵噭╅g及2 種DNA間的疊加而導(dǎo)致其靈敏度降低至0.1 ng/μL， 而水牛和牦牛的檢測(cè)靈敏度仍保持在與單重real-time PCR的水平（0.025 ng/μL）一樣，并未下降（表5）。

表5 雙重和三重real-time PCR同步檢測(cè)黃牛、水牛及牦牛Table 5 Simultaneous detection of yellow cattle-, buffalo- and yakderived components by duplex and triplex real-time PCR

但雙重變成三重real-time PCR后，結(jié)果則大不相同，即便是在最高的起始質(zhì)量濃度下（25 ng/μL），黃牛和水牛的檢測(cè)都未得到陽性結(jié)果，但牦牛的檢測(cè)靈敏度仍然保持在0.025 ng/μL，未受到三重的影響。為了提高三重real-time PCR檢測(cè)中黃牛和水牛的檢測(cè)靈敏度，調(diào)整3 種引物探針組合的濃度比例。比較8 種混合比例，提高黃牛和水牛的引物探針比例有助于提高檢測(cè)靈敏度，表6顯示，當(dāng)黃牛、水牛、牦牛3 組引物探針的比例調(diào)節(jié)為3∶3∶2時(shí)，黃牛和水牛的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.1 ng/μL，而牦牛的靈敏度仍可達(dá)到0.025 ng/μL，因此認(rèn)為該比例較佳。

表6 黃牛、水牛和牦牛三重real-time PCR檢測(cè)體系優(yōu)化Table 6 Optimization of triplex real-time PCR systems for cattle-, buffalo- and yak-derived components

楊冬燕等[29]利用多重real-time PCR同時(shí)對(duì)豬、牛、馬和鴨進(jìn)行同步檢測(cè)，在進(jìn)行多重real-time PCR同步檢測(cè)前，先對(duì)單重real-time PCR的檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化后的單重反應(yīng)體系中直接增加對(duì)應(yīng)的引物和探針，即可用于多重real-time PCR的檢測(cè)，而無需對(duì)多重realtime PCR體系進(jìn)行調(diào)整也能得到較好的結(jié)果。但本研究團(tuán)隊(duì)在對(duì)家蠶3 種疫病病原體進(jìn)行real-time PCR同步檢測(cè)[30]時(shí)也發(fā)現(xiàn)，最佳的單重檢測(cè)體系在應(yīng)用到雙重和多重real-time PCR時(shí)需要對(duì)體系進(jìn)行調(diào)整，特別是通過不同引物探針組合間比例的調(diào)整，能達(dá)到最佳的同步檢測(cè)效果。許如蘇等[31]利用鎖核酸探針（TaqMan-LNA）多重real-time PCR對(duì)牛、豬、雞、鴨等成分進(jìn)行同步檢測(cè)，也認(rèn)為通過對(duì)不同引物探針濃度比例的調(diào)整，可以得到比較好的檢測(cè)結(jié)果，如上述對(duì)應(yīng)物種的最佳引物終濃度比為6∶6∶3∶8，最佳探針終濃度比分別為3∶3∶1∶4；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，多重real-time PCR靈敏度會(huì)較單重低1 個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.4 混合樣中real-time PCR的檢測(cè)

對(duì)制成的混合肉樣用單重、雙重和三重real-time PCR進(jìn)行檢測(cè)（表7）。單重real-time PCR結(jié)果與預(yù)設(shè)結(jié)果一致；在進(jìn)行黃牛與牦牛的雙重real-time PCR時(shí)，樣品G（黃牛∶水?！藐笈?8∶1∶1）中出現(xiàn)了牦牛檢測(cè)的假陰性；在三重real-time PCR的檢測(cè)中，不論引物探針比例（黃?！盟！藐笈＃?∶3∶2或是2∶2∶1，都未在樣 品G中檢測(cè)到牦牛而產(chǎn)生假陰性，此外，樣品C（黃?！藐笈?9∶1），在引物探針比例為3∶3∶2（黃?！盟！藐笈＃┑娜豶eal-time PCR的檢測(cè)中，也出現(xiàn)了牦牛檢測(cè)的假陰性。在對(duì)混合樣的檢測(cè)中，所有的檢測(cè)不符合的情況都出現(xiàn)在雙重或者三重real-time PCR中的牦牛檢測(cè)中，且都是假陰性。樣品C和G在進(jìn)行單重real-time PCR檢測(cè)時(shí)，牦牛的檢測(cè)結(jié)果都呈陽性，說明后續(xù)雙重和三重real-time PCR檢測(cè)的陰性并非樣品混樣不勻造成。

表7 混合肉樣的real-time PCR檢測(cè)結(jié)果Table 7 Real-time PCR results for mixed meat samples

同時(shí)也對(duì)混合的DNA樣品進(jìn)行了單重、雙重和三重real-time PCR的檢測(cè)（表8）。雖然DNA混合的比例和肉樣混合的比例一致，但兩組樣品的檢測(cè)結(jié)果卻并不一致。在混合的DNA樣品中，也出現(xiàn)了假陰性的結(jié)果，但都出現(xiàn)在黃牛的檢測(cè)中：樣品D’（黃牛∶牦牛=1∶9）和I′（黃?！盟！藐笈?1∶1∶8）在雙重及三重real-time PCR中，都沒有檢測(cè)到黃牛的DNA；樣品H’（黃?！盟！藐笈?1∶8∶1）的檢測(cè)中，也未能在三重real-time PCR中檢測(cè)到黃牛。在DNA混合樣中（表8），3 種牛的DNA質(zhì)量濃度均選用了10 ng/μL，將DNA質(zhì)量濃度都調(diào)整為25 ng/μL，再按照表1體積比對(duì)3 種DNA進(jìn)行混合，得到的結(jié)果和表8略有不同：此濃度下只有樣品D’（黃?！藐笈?1∶9）存在檢測(cè)的假陰性，即在雙重和三重realtime PCR檢測(cè)中都未檢測(cè)到黃牛DNA，而其余樣品的檢測(cè)結(jié)果均與設(shè)置一致。

表8 混合DNA的real-time PCR檢測(cè)結(jié)果Table 8 Real-time PCR results for mixed DNA samples

表6中得到的最佳引物探針比例是在3 種牛的DNA含量為1∶1∶1的情況下得到的，但當(dāng)三者的比例存在大幅度差異的時(shí)候，特別是黃牛和牦牛的含量差異較大時(shí)，如表7中的樣品C和G，表8中的樣品D′和I′，含量低的物種很可能會(huì)出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。但水牛的檢測(cè)，并沒有因?yàn)楹康椭?0%而出現(xiàn)假陰性。黃牛和牦牛都屬于牛屬（Bos），種屬間的親緣關(guān)系近，相比較水牛屬于水牛屬（Bubalus），與黃牛、牦牛的種源關(guān)系較遠(yuǎn)。在同步的多重real-time PCR檢測(cè)中，若檢測(cè)的目標(biāo)物種種屬關(guān)系親密，同時(shí)樣品為復(fù)合樣品，即幾種種屬關(guān)系親密的物種同時(shí)存在于一個(gè)樣品中，且含量差異較大，則量少的物種可能會(huì)存在檢測(cè)的假陰性。本研究沒有通過調(diào)節(jié)各組引物探針的比例去克服假陰性，因?yàn)樵趯?shí)際檢測(cè)的樣品中，無法預(yù)知各種牛成分含量的比例。

楊冬燕等[29]也對(duì)混合肉樣進(jìn)行了三重real-time PCR同步檢測(cè)，對(duì)豬、牛、馬和鴨4 種成分的檢出限在5%～15%之間，且檢測(cè)過程中并沒有出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。豬、牛、馬和鴨，4 種物種間的種屬關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是該三重real-time PCR成功同步檢測(cè)的重要前提。

3 結(jié) 論

本研究基于具有物種特異性的線粒體基因，設(shè)計(jì)可鑒定黃牛、水牛和牦牛的引物探針各1 組，并在3 個(gè)探針上分別標(biāo)記了不同的熒光信號(hào)，在優(yōu)化三重real-time PCR的條件下，實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)黃牛、水牛和牦牛成分。但由于三重real-time PCR對(duì)混合樣中含量較低的黃牛和牦牛的檢測(cè)存在假陰性的可能，因此，建議在對(duì)整塊肉的樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)采用三重real-time PCR的方法同步檢測(cè)3 種牛的成分，若樣品為混合物，如肉丸、肉松等，則用單重real-time PCR檢測(cè)更精準(zhǔn)。