李祥升，常立春，陳海旭，武 劍，梁建麗，林潤(rùn)茂，郭新磊，高 杰，王曉武

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院, 烏魯木齊 830052；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 北京 100081)

0 引 言

【研究意義】芥菜(2n=36，BrassicajunceaL.)是十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)植物，包括根用芥菜、莖用芥菜、葉用芥菜和薹用芥菜等[1]。其中，葉用芥菜(Brassicajunceavar.foliosaBailey)中的包心芥菜(Brassicajunceavar.capitataHort)易于栽培、生長(zhǎng)周期短，隨著酸菜工廠化加工技術(shù)不斷發(fā)展，種植面積逐漸擴(kuò)大[2-3]。包心芥菜的包心比較松散，結(jié)球性差。目前，我國(guó)使用的芥菜類品種主要是地方常規(guī)品種，品種雜亂[4-5]，HRM技術(shù)結(jié)合InDel標(biāo)記分型具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、通量大、基因分型準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。開發(fā)一套可區(qū)分白菜與芥菜的HRM-InDel標(biāo)記有利于在芥菜雜交育種中實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)基因型，加速雜交育種進(jìn)程。【前人研究進(jìn)展】芥菜由蕓薹屬的2個(gè)二倍體基本種白菜(A基因組)和黑芥(B基因組)通過天然雜交和基因組自然加倍形成，屬于異源四倍體(AABB)。目前，芥菜研究主要集中在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和高產(chǎn)栽培與加工等。徐書法等[6]將芥菜與大白菜進(jìn)行了遠(yuǎn)緣雜交。Srivastava等[7]通過遠(yuǎn)緣雜交，采用蕪菁和黑芥雜交后人工加倍合成了芥菜型油菜。魏素萍[8]利用蔬菜用芥菜與白菜型油菜雜交，以芥菜為輪回親本獲得了回交一代群體。水稻、玉米、白菜、番茄等作物研究中均已應(yīng)用InDel標(biāo)記，并取得了一定的成果[9-12]。Liu等[13]開發(fā)了覆蓋白菜全基因組的639個(gè)InDel標(biāo)記，并篩選出387個(gè)具有多態(tài)性性的標(biāo)記，對(duì)大白菜分子標(biāo)記輔助育種研究積累了標(biāo)記材料。張志剛等[14-15]基于白菜全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)并篩選出了593個(gè)具有多態(tài)性的InDel標(biāo)記，并篩選出了一批剩余雜合體單株，還獲得了20對(duì)可基于HRM技術(shù)分型的標(biāo)記。陳榮等[16]基于白菜全基因組測(cè)序開發(fā)了252個(gè)可用于HRM分型的InDel標(biāo)記，篩選出了148對(duì)在結(jié)球白菜與不結(jié)球白菜中有多態(tài)性的標(biāo)記，優(yōu)化了HRM分型的技術(shù)體系。【本研究切入點(diǎn)】采取傳統(tǒng)育種方式選育芥菜新品種較多，將分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)應(yīng)用于芥菜育種中尚不多。目前，基于HRM技術(shù)和InDel標(biāo)記的分子標(biāo)記輔助技術(shù)，在芥菜遠(yuǎn)緣雜交育種中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。研究遠(yuǎn)緣雜交將結(jié)球白菜的A基因組導(dǎo)入包心芥菜?！緮M解決的關(guān)鍵問題】運(yùn)用遠(yuǎn)緣雜交將結(jié)球白菜中控制結(jié)球的基因?qū)虢娌酥校捎肐nDel標(biāo)記和HRM分型平臺(tái)，利用分子標(biāo)記輔助選擇的手段，篩選回交過程中保留較多白菜基因的材料，改善包心芥菜的結(jié)球性，豐富包心芥菜的種質(zhì)資源，拓寬分子標(biāo)記輔助芥菜育種的方法，為芥菜類作物的優(yōu)異基因資源挖掘、農(nóng)藝性狀改良積累芥菜材料和InDel標(biāo)記提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

2018年秋季，將6份芥菜親本和2份白菜親本材料種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南區(qū)日光溫室，2019年春，以芥菜為母本與白菜雜交獲得F1，以包心芥菜作為輪回親本與獲得的F1進(jìn)行回交，2019年夏秋獲得BC1幼苗。2018年秋至2019年春以包心芥菜為輪回親本，對(duì)已有F1材料進(jìn)行回交收種，2019年春獲得BC1幼苗。表1

表1 親本信息及雜交群體編號(hào)Table 1 Parental information and hybrid group number

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供根據(jù)白菜設(shè)計(jì)的InDel標(biāo)記。

1.2 方 法

1.2.1 雜交與回交

雜交：2018年秋將親本播入穴盤，發(fā)芽后4℃春化，時(shí)間為30 d。春化完成后將穴盤移入溫室，幼苗長(zhǎng)出4～5片真葉時(shí)移入花盆，開花后以包心芥菜為母本(開花前1～3 d的花蕾)，以結(jié)球白菜為父本進(jìn)行雜交獲得F1，時(shí)間選擇在09：00～16：00。

回交：以F1為母本與輪回親本芥菜回交，花序不去頂，時(shí)間09:00～16:00。

結(jié)籽率和回交率：共獲得9個(gè)種間雜種組合。其中，芥菜與結(jié)球白菜B9008雜交的組合均獲得F1后代，而芥菜與結(jié)球白菜Chiifu雜交的組合中，只有3個(gè)組合獲得F1后代，其余3個(gè)組合未能獲得雜種一代，統(tǒng)計(jì)結(jié)籽率。F1種子或幼胚通過幼胚培養(yǎng)技術(shù)迅速培養(yǎng)成苗，并以芥菜為輪回親本進(jìn)行回交，統(tǒng)計(jì)回交結(jié)籽率。

1.2.2 幼胚培養(yǎng)

在魏素萍[8]基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。取授粉后20～25 d的膨大的未成熟的角果，用清水沖洗干凈，用75%的酒精處理種莢1 min，用無菌水洗滌2次，再轉(zhuǎn)入2%的NaClO溶液中消毒3～5 min，然用無菌水洗滌2次。用解剖針和鑷子將胚剝離出來，放入蔗糖含量2.6%的B5或MS培養(yǎng)基上。置于25℃，光照12 h的組培間中培養(yǎng)成苗。

1.2.3 F1真實(shí)性判定

由于真雜合子代為三倍體，高度不育，觀察開花后結(jié)實(shí)判定F1是否為真雜合子代。

對(duì)F1回交時(shí)，選用6份芥親本中的3份作為回交親本。

1.2.4 DNA提取

采用磁珠法提取親本及雜交子代葉片基因組DNA。提取的DNA經(jīng)NanoDrop 1000(Thermo，USA)檢測(cè)其純度和濃度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA質(zhì)量。將DNA的一部分稀釋到20 ng/μL為工作液，剩余的DNA保存在-20°C備用。

1.2.5 PCR擴(kuò)增和HRM基因分型

PCR擴(kuò)增和HRM基因分型體系采用實(shí)驗(yàn)室已開發(fā)的技術(shù)體系[16]。PCR反應(yīng)在384孔PCR板上進(jìn)行。PCR反應(yīng)和HRM基因分型在Quant Studio 12K Flex Real-Time儀器上進(jìn)行，同時(shí)用普通PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，之后在Quant Studio 12K儀器上進(jìn)行HRM基因分型，以提高標(biāo)記篩選通量。HRM基因分型完成后，導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片和EXCEL數(shù)據(jù)表。

2 結(jié)果與分析

2.1 種間雜種F1及其回交結(jié)籽率

研究表明，不同組合的結(jié)籽率存在差異。結(jié)球白菜B9008作父本時(shí)，雜交組合的結(jié)籽率為12.50%～78.38%，均值為35.97%，回交結(jié)籽率為3.48%～19.28%，均值為8.10%。其中結(jié)籽率最高的是YZ17JC189，YZ17JC042次之，與YZ17JC124的結(jié)籽率最低。當(dāng)結(jié)球白菜Chiifu作父本時(shí)，雜交組合的結(jié)籽率為16.28%～48.39%，均值為34.69%，回交結(jié)籽率為0～3.52%，均值為2.28%。雜交過程結(jié)籽率較B9008作親本時(shí)有所降低，但依舊是與包心芥菜YZ17JC189和YZ17JC042的親和性較高。組合YZ17JC189×Chiifu未獲得BC1群體，回交過程中的結(jié)籽率普遍低于雜交過程的結(jié)籽率。其中，雜交組合YZ17JC124×B9008在回交時(shí)結(jié)籽率最高，高出結(jié)籽率最低的組合YZ17JC042×B9008近6倍，比遠(yuǎn)緣雜交時(shí)的結(jié)籽率高出將近7個(gè)百分點(diǎn)，該組合回交時(shí)結(jié)籽率較高。而雜交組合YZ17JC124×Chiifu回交時(shí)結(jié)籽率較低。圖1

2.2 F1群體回交收種

研究表明，18NP164.jc回交結(jié)籽率為1.04%～24.18%，均值為15.77%，18NP173.jc回交結(jié)籽率為1.06%～3.23%，均值為2.40%。材料18NP164.jc×YZ17JC042和18NP164.jc×YZ17JC115在未用幼胚培養(yǎng)技術(shù)輔助回交的情況下結(jié)籽率較高，與材料18NP173.jc相關(guān)的回交組合在無幼胚培養(yǎng)輔助的情況下，結(jié)籽率普遍低于幼胚培養(yǎng)的材料。排除結(jié)籽率較高和最低的組合之后，回交中使用幼胚培養(yǎng)的組合結(jié)籽率均值為4.64%，而未使用幼胚培養(yǎng)技術(shù)的回交組合結(jié)籽率均值為2.40%。圖1，圖2

2.3 可區(qū)分白菜與芥菜的InDel標(biāo)記篩選結(jié)果

研究表明，共選出203個(gè)在結(jié)球白菜與包心芥菜間具有多態(tài)性的InDel標(biāo)記。其中有49個(gè)標(biāo)記可準(zhǔn)確區(qū)分供試的8份包心芥菜和7份結(jié)球白菜，154個(gè)無法將全部供試白菜與芥菜區(qū)分開，可以有針對(duì)性的使用。可分型標(biāo)記占總標(biāo)記的50.62%，可區(qū)分所有供試材料的標(biāo)記占比為12.22%。

2.4 用于BC1群體篩查的引物

研究表明，篩選出的49個(gè)可用標(biāo)記中選出20個(gè)分型效果較好的標(biāo)記，覆蓋到每條染色，利用這些標(biāo)記追蹤BC1群體的白菜基因。表2

2.5 標(biāo)記在回交群體中的InDel分型

研究表明，所有單株均攜帶白菜基因，單株中白菜標(biāo)記占比為30%～100%，平均占比為73.80%。絕大部分單株攜帶的白菜特異標(biāo)記在50%以上，在回交過程中白菜基因更容易保留。特別是以B9008為白菜親本的組合XS1255×JC124，不僅單株最多，而且所有單株的標(biāo)記含量都在50%以上。圖3

BC1群體中雜合比例為64.06%～77.49%，均值為71.53%，顯著高于理論值50%(P<0.01)，回交時(shí)F1中的白菜A基因組和芥菜A基因組并不是按照理論意義上的1∶1傳遞的，而是保留了較多的白菜基因。圖4

根據(jù)白菜親本差異將192棵單株分為8個(gè)組，各群體的白菜標(biāo)記占比均高于50%。最高的是組合LXS1259，白菜標(biāo)記占比達(dá)到了81.67%；白菜親本為Chiifu的群體中白菜基因占比最低，為51.82%。圖5

分組為L(zhǎng)XS1254和“其它”的2組有部分標(biāo)記在群體中的占比低于50%，其余分組中的每個(gè)標(biāo)記在群體中的占比均高于50%。Chiifu為白菜親本的群體中有9對(duì)標(biāo)記的雜合比例低于50%，最低值為27.27%，最高值為72.73%。以50%為檢驗(yàn)值，對(duì)8個(gè)分組中各個(gè)標(biāo)記的占比進(jìn)行T檢驗(yàn)，除組名為Chiifu的分組外，所有分組的P值均小于0.05，而分組為Chiifu的群體中P=0.56>0.05。在白菜親本非Chiifu的群體中，白菜標(biāo)記占比顯著高于50%，偏向于白菜基因的傳遞，不符合回交后代1∶1的分離比；白菜親本為Chiifu的群體中白菜標(biāo)記占比與理論值50%無明顯差異，符合回交后代1：1的分離比。圖6

3 討 論

遠(yuǎn)緣雜交普遍存在生殖隔離和后代不育問題，難以通過單純的有性雜交獲得雜種后代。遠(yuǎn)緣雜交后代育性較低或敗育是育種工作中的常見現(xiàn)象，研究回交過程的結(jié)籽率普遍低于遠(yuǎn)緣雜交過程的結(jié)實(shí)率證實(shí)了這一點(diǎn)。而這特點(diǎn)剛好可用于鑒定雜交種，尤其在三倍體F1的雜種鑒定中具有極強(qiáng)的實(shí)用性。F1的基因型為AAB，B基因組在減數(shù)分裂中多以單價(jià)體形式存在，難以進(jìn)行正常的減數(shù)分裂[17]。異源三倍體減數(shù)分裂過程中來自親本的染色體難以正常配對(duì)，這也是導(dǎo)致敗育的重要原因[18]。但這并不意味著三倍體都無法產(chǎn)生配子，有些物種可以產(chǎn)生非整倍體配子，甚至存在整倍體配子產(chǎn)生，并且能夠產(chǎn)生后代[19]。有多個(gè)研究通過培養(yǎng)子房或幼胚，均獲得了理想材料[20-24]。研究利用幼胚培養(yǎng)技術(shù)，在胚珠敗育之前或剛發(fā)生敗育時(shí)人工干預(yù)，在回交過程中起到了很大作用，篩選出了理想的芥菜與白菜雜交的組合YZ17JC042×B9008、YZ17JC189×B9008、YZ17JC042×Chiifu和YZ17JC189×Chiifu。

幼胚培養(yǎng)技術(shù)可提高結(jié)籽率。柳霖坡[25]利用幼胚培養(yǎng)技術(shù)將四倍體甘藍(lán)與二倍體甘藍(lán)雜交結(jié)籽率從3.79%提高到了53.33%。研究發(fā)現(xiàn)未使用幼胚培養(yǎng)技術(shù)的組合，其回交結(jié)籽率普遍較低。回交中使用幼胚培養(yǎng)的組合結(jié)籽率均值為4.64%，而未使用幼胚培養(yǎng)技術(shù)的回交組合結(jié)籽率均值為2.40%。但在遠(yuǎn)緣雜交過程中有的組合因?yàn)樯掣綦x嚴(yán)重，沒有獲得雜種后代，并且獲得雜交后代的組合親和性也各不相同。

偏分離是生物界廣泛存在的現(xiàn)象，指的是分離群體基因分型比不遵循孟德爾分離規(guī)律[26]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，多種作物的遺傳圖譜相繼構(gòu)建出來。在玉米、水稻、小麥、棉花、南瓜和白菜等作物中均發(fā)現(xiàn)了大量的偏分離位點(diǎn)[27-32]。但前人的研究多是利用品種間或亞種雜交分離后代繪制遺傳圖譜，且僅部分標(biāo)記位點(diǎn)存在偏分離現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，所有白菜標(biāo)記位點(diǎn)在回交群體中均偏向于保留白菜基因。研究結(jié)果顯示，各標(biāo)記在全部BC1單株的雜合比例為64.06%～77.49%，均高于理論上的50%，以50%為檢測(cè)值，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示P<0.01，差異顯著，明顯偏向于傳遞白菜基因。除白菜親本為Chiifu的群體外，各群體均明顯偏向于傳遞白菜基因，來自于白菜A基因組的基因在雜交群體中傳遞的概率超過了芥菜A基因組。偏分離與雜種群體的親本有一定關(guān)系，Chiifu群體雖無顯著偏分離現(xiàn)象，但分離群體雜合比例為51.82%，如群體單株數(shù)量足夠多亦有出現(xiàn)顯著偏分離的。這種遠(yuǎn)緣雜交偏向保留白菜基因的分離現(xiàn)象對(duì)研究是有利的，偏分離被認(rèn)為是作物進(jìn)化的一種重要?jiǎng)恿33]。研究中偏分離現(xiàn)象的產(chǎn)生或與配子或合子的選擇有關(guān)[34]，在配子或合子形成的過程中，包含白菜基因較多的配子或合子被保留了下來，而包含白菜基因少的配子或合子選擇性凋亡，這和Xu等[35]認(rèn)為雄配子體選擇性保留的結(jié)果一致。但與前人研究不同的是，研究中的所有標(biāo)記均存在偏分離現(xiàn)象，這一對(duì)遠(yuǎn)緣雜交工作有利的現(xiàn)象值得關(guān)注。

4 結(jié) 論

4.1材料YZ17JC189只在與白菜親本B9008組合時(shí)，后代與芥菜回交結(jié)籽率較高，與其它白菜組合時(shí)回交結(jié)籽率均較低，回交結(jié)籽率與白菜親本有關(guān)。在利用白菜A基因組進(jìn)行芥菜資源創(chuàng)制過程中，最好選擇多個(gè)同類型不同材料作為親本，以便從中選擇出結(jié)籽率較高的回交組合。

4.2遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合幼胚培養(yǎng)獲得了9個(gè)種間雜種組合和14個(gè)BC1群體。篩選出了芥菜與白菜遠(yuǎn)緣雜交結(jié)籽率高的4個(gè)組合YZ17JC042×B9008、YZ17JC189×B9008、YZ17JC042×Chiifu和YZ17JC189×Chiifu；并篩選出了3個(gè)回交結(jié)籽率高的理想組合18NP164.jc×042、18NP164.jc×115和XS1256×YZ17JC124(YZ17JC124×B9008)。證實(shí)了三倍體高度不育性在蕓薹屬間雜種鑒定中的實(shí)用性，三倍體雜種育性較低，回交一代BC1比雜種一代F1更難獲得。以結(jié)球白菜B9008作父本的組合為例，雜交過程的結(jié)籽率均值為35.97%，而回交過程結(jié)籽率8.10%。發(fā)現(xiàn)了幼胚培養(yǎng)技術(shù)輔助回交可有效提高結(jié)籽率?；亟贿^程中利用幼胚培養(yǎng)的組合結(jié)籽率均值為4.72%，而未使用幼胚培養(yǎng)技術(shù)的回交組合結(jié)籽率均值為2.9%。

4.3在回交群體中存在明顯偏分離現(xiàn)象，偏向于傳遞白菜基因。利用20個(gè)InDel標(biāo)記追蹤192株BC1單株的白菜基因，各標(biāo)記在全部BC1單株的雜合比例為64.06%～77.49%，均高于理論上的50%，以50%為檢測(cè)值，P<0.01，差異顯著，明顯偏向于傳遞白菜基因。有一半單株的標(biāo)記占比在78.3%以上，有54棵單株標(biāo)記占比超過90%。