雙水相系統(tǒng)提取槐米總黃酮的工藝研究

張愛珍，侯巧芝，霍柯柯

（1.河南地礦職業(yè)學(xué)院，河南鄭州451464；2.黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450063）

槐米是夏季槐花未開放時(shí)采摘的花蕾，其有效成分是黃酮類化合物——蘆?。ㄊ|香苷）。黃酮類化合物是一大類廣泛存在于植物中的化合物，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗菌及抗氧化等多種生物活性[1-3]。黃酮類化合物的主要提取方法有堿提酸沉法[4-5]、溶劑提取法[6-8]、水煎煮法[9]、微波輔助提取法[10-11]、超聲輔助提取法[12]、雙水相系統(tǒng)提取法[13]及超臨界提取法[14]等。黃酮類化合物常用的有機(jī)溶劑提取法提取時(shí)間比較長(zhǎng)。雙水相系統(tǒng)提取法是利用高聚物-高聚物或高聚物-低分子鹽形成雙液體系，當(dāng)兩種物質(zhì)濃度達(dá)到臨界濃度時(shí)，該體系變?yōu)殡p水相體系，被分離物在兩相中因具有分配差異而被提取。雙水相系統(tǒng)提取法具有技術(shù)簡(jiǎn)單、分離速度快、易于純化、宜于放大進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是天然產(chǎn)物活性成分提取的一種理想技術(shù)[15-18]。本文以槐米為研究對(duì)象，以聚乙二醇1000（polyethylene glycol 1000，PEG 1000）與硫酸銨雙水相系統(tǒng)為介質(zhì)，超聲輔助提取槐米中的總黃酮，利用可見分光光度法對(duì)槐米中的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，探究最佳的提取工藝，以期為黃酮類化合物的工業(yè)化開發(fā)的研究提供一定的方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槐米：市售。將槐米放于恒溫50℃的烘箱干燥2 h，粉碎過80目篩后裝瓶備用。

聚乙二醇1000（化學(xué)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉（以上均為分析純）：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；蕓香苷水合物標(biāo)準(zhǔn)品（優(yōu)級(jí)純）：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

可見分光光度計(jì)（7230G）：上海菁華科技儀器有限公司；高速中藥粉碎機(jī)（XFB-200）：吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；超聲波清洗器（KQ-300V型）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雙水相體系的選擇

配制40%的PEG 1000和40%的硫酸銨溶液。取配制好的兩種溶液，按照PEG 1000溶液和硫酸銨溶液體積比分別為 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混合，總體積均為10mL，置于離心管中，搖勻，靜置1h，觀察分層情況并分別記錄上下相體積之比。

1.3.2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[19]檢測(cè)總黃酮含量。稱取10mg蕓香苷水合物，加水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，搖勻，得0.1 mg/mL的蕓香苷水合物標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管分別吸取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL 的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液于 50 mL的容量瓶中，加入蒸餾水約至25 mL，然后依次加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，再加入4%的氫氧化鈉溶液2 mL及60%的乙醇溶液10 mL，最后用蒸餾水定容，搖勻靜置25 min。不加槐米的作為空白對(duì)照組。在510 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 槐米中總黃酮的分離提取

稱取槐米粉末 1 g，按料液比 1∶40（g/mL）溶解于40 mL雙水相系統(tǒng)中，在30℃下超聲30 min，抽濾，將濾液倒入離心管中，靜置10 min，記錄上下相的體積之比。分別取上下相各1 mL于50 mL容量瓶中，加入適量的蒸餾水稀釋，按1.3.2的比色法測(cè)定吸光度，然后計(jì)算總黃酮的含量。

1.3.4 槐米中總黃酮萃取率和得率的測(cè)定和計(jì)算[20]

Y/%=RK/（1+RK）×100，R=V上/V下，K=A上/A下

式中：R為上下相的體積比，V上、V下分別為上、下相體積，mL；K為總黃酮在兩相中的分配系數(shù)，A上、A下分別為上、下相吸光度，Y為萃取率。

式中：Y'為總黃酮得率，mg/g；C為總黃酮質(zhì)量濃度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到，mg/mL，V為待測(cè)液的體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為槐米粉末的質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

固定其他條件，改變其中的一個(gè)條件，分別考察PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20%、22%、24%、26%、28%、30%、32%）、料液比 [1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]、浸提溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%）4個(gè)因素對(duì)總黃酮萃取率的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，確定槐米總黃酮提取的最優(yōu)工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相系統(tǒng)中PEG 1000溶液與硫酸銨溶液不同體積比時(shí)的分相結(jié)果

雙水相系統(tǒng)中PEG 1000溶液與硫酸銨溶液不同體積比的分相結(jié)果見表1。

表1 雙水相系統(tǒng)中PEG 1000與硫酸銨溶液不同體積比的分相結(jié)果Table 1 Volume ratio of aqueous two-phase system mixed by polyethylene glycol 1000 solution and ammonium sulfate solution

從表1中可以看出，在PEG1000溶液和硫酸銨溶液體積比為6∶4時(shí)，雙水相系統(tǒng)中上下相體積差最小，因此試驗(yàn)選用PEG1000溶液和硫酸銨溶液6∶4的體積比。

2.2 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度A對(duì)濃度C（mg/mL）作圖，得到蕓香苷水合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蕓香苷水合物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Absorbance-concentration standard curve of rutin hydrate

回歸方程為y=14.19x-0.000 3，相關(guān)系數(shù)R為0.999 8，表明吸光度與濃度在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3 單因素影響結(jié)果

2.3.1 PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)槐米總黃酮萃取的影響

PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響見圖2。

圖2 PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響Fig.2 Effect of PEG 1000 mass fraction on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可以看出，當(dāng)PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加時(shí)，槐米總黃酮的萃取率先增加后降低。在PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%時(shí)，總黃酮的萃取率最大。因此，在正交試驗(yàn)時(shí)，選取PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24%、26%和28%。

2.3.2 料液比對(duì)槐米總黃酮萃取的影響

料液比對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可以看出，隨著液體體積逐漸增加，槐米總黃酮的萃取率呈增加趨勢(shì)，總黃酮的萃取率在料液比1∶60（g/mL）時(shí)最大，然后減小。結(jié)合試驗(yàn)，正交試驗(yàn)選擇料液比分別為 1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）。

2.3.3 浸提溫度對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響

浸提溫度對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響見圖4。

圖4 浸提溫度對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，當(dāng)浸提溫度不斷升高時(shí)，槐米總黃酮的萃取率先增加后降低。在50℃時(shí)達(dá)最大值，之后隨著浸提溫度的升高逐漸減小。結(jié)合試驗(yàn)和經(jīng)濟(jì)成本因素，正交試驗(yàn)選取浸提溫度為40、50、60℃。

2.3.4 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響

硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響見圖5。

圖5 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響Fig.5 Effect of ammonium sulfate mass fraction on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，總黃酮的萃取率最大，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，總黃酮的萃取率變小。結(jié)合試驗(yàn)，選取正交試驗(yàn)的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、12%和14%。

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，選取PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、浸提溫度、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)4個(gè)因素，通過正交試驗(yàn)研究了萃取最佳條件。因素水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果分析及方差分析見表3、表4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Orthogonal experiment factors and levels of the flavonoids

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table3 Orthogonal experiment results and analysis of the flavonoids

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of the orthogonal array design

由表4可知，正交試驗(yàn)的各因素對(duì)提取率的影響均不顯著。綜合表3和表4可以得出影響總黃酮萃取率的主次順序?yàn)镈＞C＞A＞B，即硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)槐米總黃酮萃取率的影響最大，其次為浸提溫度，PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮萃取率的影響最小。從正交試驗(yàn)結(jié)果分析可得出提取總黃酮最優(yōu)工藝條件為A3B2C1D1，即 PEG 1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 28%，料液比 1∶60（g/mL），浸提溫度40℃，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。

2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

在 PEG1000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 28%，料液比 1∶60（g/mL），浸提溫度40℃，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，超聲時(shí)間30 min的條件下，進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，萃取3次，總黃酮的平均萃取率為95.91%，得率為20.53 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.248 7%，結(jié)果重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)得到了雙水相系統(tǒng)萃取槐米總黃酮的最優(yōu)工藝為PEG 1000質(zhì)量分?jǐn)?shù) 28%，料液比為 1∶60（g/mL），浸提溫度 40 ℃，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。在該條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，總黃酮的萃取率為95.91%，得率為20.53 mg/g。結(jié)果重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定可行。該提取方法可為槐米總黃酮的工業(yè)化開發(fā)的研究提供一定的方法參考。