非洲豬瘟病毒與天然免疫系統(tǒng)相互作用研究進(jìn)展

屈海龍，戈勝強(qiáng)，張永強(qiáng)，韓乃君，孫成友，吳曉東，王志亮 (中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032)

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的一種出血性豬病毒性疾病，可以感染野豬和家豬。強(qiáng)毒株感染的致死率可達(dá)100%，毒性較低的毒株可導(dǎo)致亞臨床癥狀，甚至是慢性感染。該疾病的急性形式以發(fā)燒、食欲不振、嗜睡和出血為特征[1]。由于ASF的破壞性影響，該疾病被列入世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)必須報(bào)告的疾病。

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，屬于核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV)[2]。最早在1921年，ASFV在肯尼亞作為一種地方性病毒被首次發(fā)現(xiàn)[3]。自此，ASF在許多撒哈拉以南國家流行。20世紀(jì)中葉擴(kuò)散到歐洲，后來又?jǐn)U散到南美洲和加勒比地區(qū)。20世紀(jì)90年代，歐洲(撒丁島除外)通過嚴(yán)格的生物安全計(jì)劃和措施控制并凈化了ASF。但僅僅控制了10年，在2007年，ASFV通過格魯吉亞重新進(jìn)入歐洲，并迅速蔓延到俄羅斯等東歐等國家[4-6]。2014年，ASFV 首次傳入歐洲聯(lián)盟(EU)國家[7]。2018年8月，我國暴發(fā)首起ASF疫情，截止到2021年7月，我國31個(gè)省、市、自治區(qū)、直轄市共計(jì)暴發(fā)187起ASF疫情，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了災(zāi)難性的影響，嚴(yán)重影響了我國畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。由于ASFV復(fù)雜的生物學(xué)特性以及感染引起的宿主免疫反應(yīng)機(jī)制還不完全清楚[8]，目前還沒有針對ASF的商業(yè)化疫苗和抗病毒藥物[9]。但是，研究人員在抗ASFV免疫和開發(fā)ASF候選疫苗方面做了大量的工作[10]，給未來疫苗及抗病毒藥物的研發(fā)帶來了希望。

天然免疫系統(tǒng)是抵御所有感染的第1道防線，是特異性免疫反應(yīng)的前哨[11]。ASFV可以感染脊椎動(dòng)物(家豬和野豬)，也可以感染無脊椎動(dòng)物(軟蜱)，而這2個(gè)宿主只有天然免疫反應(yīng)是共同的，因此可以合理地推測ASFV已經(jīng)進(jìn)化出操縱宿主天然免疫系統(tǒng)的基因，以維持自身對宿主的持續(xù)感染[12]。近年來，隨著不斷深入研究，ASFV感染與宿主天然免疫系統(tǒng)的關(guān)系不斷被揭示，現(xiàn)就ASFV感染與宿主天然免疫應(yīng)答及其免疫抑制機(jī)理研究的進(jìn)展進(jìn)行綜述，希望能為ASF的防控提供參考。

1 ASFV概述

ASFV是一種線性的有囊膜的雙鏈DNA病毒，完整的病毒顆粒有5層結(jié)構(gòu)，總體上呈二十面體形態(tài)，直徑大小為260～300 nm[2,13]。ASFV具有線性雙鏈DNA基因組，大小為170～194 kb，可編碼150～170個(gè)開放閱讀框(ORF)，其中近一半基因的功能尚不清楚[14-15]。ASFV顆粒包含50多種蛋白[13,16]，并可在感染細(xì)胞中產(chǎn)生150多種蛋白質(zhì)[14,17]。ASFV的主要靶細(xì)胞是豬的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞[18-19]，也可在其他類型細(xì)胞中復(fù)制，包括肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[20-22]。根據(jù)ASFV B646L基因C末端核酸序列的差異和紅細(xì)胞吸附抑制實(shí)驗(yàn)，將ASFV分成了24個(gè)基因型8個(gè)血清群[14,23]，引起我國暴發(fā)首起ASF疫情的毒株屬于基因Ⅱ型血清8群[24]。

2 ASFV與干擾素

干擾素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性糖蛋白，分為Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素，是天然免疫的重要組成部分。Ⅰ型干擾素具有廣譜的抗病毒活性，Ⅱ型干擾素具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。干擾素能抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的傳播和早期感染細(xì)胞的細(xì)胞間傳播，從而抑制病毒在感染細(xì)胞中的復(fù)制[11]。

2.1 ASFV抗宿主Ⅰ型干擾素反應(yīng)病毒通常通過病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，被細(xì)胞表面或細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別。先天性免疫反應(yīng)在感受到PAMP時(shí)被觸發(fā)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素表達(dá)[25-26]。ASFV作為細(xì)胞質(zhì)DNA病毒，DNA的感應(yīng)途徑可能是感應(yīng)感染和誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的關(guān)鍵。目前，尚不清楚在ASFV感染巨噬細(xì)胞時(shí)PAMP和PRR的具體機(jī)制[8]。

先前的研究表明，ASFV編碼的MGF360和MGF505(也稱為MGF530)通過抑制宿主細(xì)胞干擾素表達(dá)，達(dá)到抑制病毒胞內(nèi)復(fù)制的目的[27]。Pr4Δ35為缺失8個(gè)MGF360和MGF505基因的重組毒株，可在體外誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α，而親本Pr4株則不會(huì)。在用2 000 IU/mL重組IFN-α處理肺泡巨噬細(xì)胞后，Pr4Δ35的復(fù)制顯著減少。相比之下，親代Pr4病毒的復(fù)制則不受IFN-α的抑制[27-28]。IFN-α不會(huì)影響強(qiáng)毒ASFV(BA71、Georgia 2007/1、OUR T88/1)在肺泡巨噬細(xì)胞中復(fù)制的能力。但是，通過用2 000 IU/mL重組IFN-α預(yù)處理細(xì)胞，OUR T88/3的復(fù)制減少了約90%[28]。作為MGF360的成員，A276R基因不僅通過靶向干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)抑制其活化，從而抑制IFN-β表達(dá)，而且還能抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)活化，但抑制NF-κB活化與抑制IFN-β表達(dá)沒有關(guān)聯(lián)[12,29]。MGF360-12L可以通過阻斷核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輸入蛋白(importin α)和NF-κB信號(hào)通路的相互作用來抑制Ⅰ型IFN的產(chǎn)生[30]。MGF505-7R(A528R)通過同時(shí)抑制IRF3和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子來抑制Ⅰ型IFN的誘導(dǎo)，該蛋白還抑制Ⅰ型和Ⅱ型干擾素信號(hào)通路[12]。MGF505-7R缺失的ASFV比野生型ASFV在體外誘導(dǎo)更多的IFN-β產(chǎn)生，并且其在體外復(fù)制能力減弱[31]。從ASFV強(qiáng)毒株中刪除不同數(shù)量的MGF360和MGF505基因，構(gòu)建的重組ASFV表現(xiàn)出明顯的毒力降低，并且能夠誘導(dǎo)宿主免疫保護(hù)反應(yīng)，保護(hù)宿主免受強(qiáng)毒株的攻擊[32-34]。ASFV的I329L蛋白與細(xì)胞膜上高度糖基化的Toll樣受體3(TLR3)十分相似，能夠抑制宿主天然免疫系統(tǒng)中的2個(gè)重要因子NF-κB和IRF3的激活，從而抑制宿主IFN-β表達(dá)[12,35]。ASFV在細(xì)胞水平上抑制Ⅰ型干擾素表達(dá)，但是研究人員發(fā)現(xiàn)被ASFV強(qiáng)毒株感染的豬血清中存在有活性的干擾素，并且同時(shí)檢測到IFN-α和IFN-β[28,36]，這說明干擾素的表達(dá)在體內(nèi)和體外還是有區(qū)別的，需要進(jìn)一步研究。

2.2 ASFV抗宿主Ⅱ型干擾素反應(yīng)Ⅱ型干擾素又稱干擾素γ(IFN-γ)，主要由活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生。由于ASFV主要的靶細(xì)胞是單核/巨噬細(xì)胞，IFN-γ可能對ASFV與宿主細(xì)胞的相互作用產(chǎn)生直接影響，特別是在病毒感染的早期階段。早在1988年，有文獻(xiàn)報(bào)道，豬IFN-γ能在體外豬巨噬細(xì)胞中抑制ASFV的復(fù)制[37]。REVILLA等[38]用無毒的ASFV注射免疫近交系豬，然后分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，發(fā)現(xiàn)只有用同源或減毒的ASFV(Ba71v、Ba71、UGA 59)刺激時(shí)，才能產(chǎn)生IFN-γ，而用異源、強(qiáng)毒的ASFV(CC83、WH55)刺激時(shí)則不能產(chǎn)生。接種無毒的ASFV OURT88/3后再接種強(qiáng)毒OURT88/1豬的每百萬PBMC中能產(chǎn)生IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)量要比單獨(dú)接種OURT88/3的多，并且與免疫保護(hù)有良好的相關(guān)性[39]。隨后通過交叉保護(hù)試驗(yàn)證明，當(dāng)免疫后豬的PBMC用其他基因Ⅰ型毒株(Benin 97/1)刺激時(shí)，可以檢測到高水平IFN-γ，Lisbon 57則不產(chǎn)生；而用基因Ⅹ型烏干達(dá)分離株刺激時(shí)則產(chǎn)生很高水平IFN-γ。通過免疫保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有能夠產(chǎn)生IFN-γ的免疫豬能夠抵抗烏干達(dá)強(qiáng)毒分離株的感染[39]。這些結(jié)果表明，IFN-γ與ASFV的免疫保護(hù)有很好的相關(guān)性。

3 ASFV與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是宿主抵抗病原體的重要防御機(jī)制，具有限制病原體復(fù)制和傳播的作用，是天然免疫的重要組成部分。許多病毒已經(jīng)進(jìn)化出多種抗細(xì)胞凋亡機(jī)制。ASFV編碼多種抗宿主細(xì)胞凋亡的蛋白，可抑制感染細(xì)胞的凋亡。

ASFV的A179L蛋白是一種B細(xì)胞淋巴瘤2樣蛋白(Bcl-2)，包含與BH3蛋白家族結(jié)構(gòu)域相似的所有結(jié)構(gòu)域，可以抑制Bax和Bak的激活，進(jìn)而通過抑制細(xì)胞色素C的釋放和凋亡酶激活因子1(APAF1)/細(xì)胞色素C復(fù)合物的形成以及Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，從而抑制宿主細(xì)胞凋亡[40-41]。A179L蛋白在ASFV感染細(xì)胞后的早期和晚期都表達(dá)，但沒有包裝到病毒顆粒中。這表明A179L可能在整個(gè)感染過程中均參與抑制細(xì)胞凋亡，但并未參與病毒核心進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的最早階段[13,42]。

ASFV的A224L蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成員，并含有BIR基序。在感染了刪除A224L基因的ASFV的細(xì)胞中，觀察到Caspase 3活性增加，說明A224L可抑制Caspase 3的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。A224L的表達(dá)可激活NF-κB，通過激活許多抗凋亡基因(包括IAP和Bcl-2家族成員)的轉(zhuǎn)錄抑制細(xì)胞凋亡。A224 L蛋白是ASFV晚期表達(dá)蛋白，被包裝到病毒顆粒中，在病毒感染的前期和后期均具有潛在作用[43-44]。與親本株相比，刪除A224L基因的ASFV強(qiáng)毒株在豬巨噬細(xì)胞中的復(fù)制并沒有變化，毒力也沒有降低[45]，NH/P68Δ224L-COS7卻能提供一定強(qiáng)毒攻擊保護(hù)，雖然在感染后期，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)了胃、肝、腎、淋巴結(jié)中度腫大和部分出血，心包積水等亞臨床癥狀[29]。說明ASFV在體內(nèi)抑制宿主細(xì)胞凋亡并不是通過單一蛋白完成，可通過其他多個(gè)基因協(xié)作彌補(bǔ)A224L的缺失。

ASFV的DP71L蛋白可以靶向性地使真核翻譯起始因子2α(eIF-2α)去磷酸化，抑制促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP的激活，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[46-47]。分別刪除ASFV Malawi Lil20/1和 ASFV E70中DP71L基因，然后用重組毒感染豬巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不會(huì)引起細(xì)胞eIF2α磷酸化水平的增加或CHOP的誘導(dǎo)，這表明DP71L不是ASFV在感染過程中控制eIF2α磷酸化水平所需的唯一基因[47]。DP71L可能不是某些ASFV毒力所需，分別從ASFV Malawi Lil20/1和ASFV Pretoriuskop/96/4中刪除全長的DP71L和截短DP71L基因，對家豬的毒力沒有影響[48]。相反，從ASFV E70中缺失或截短DP71L基因可導(dǎo)致毒力減弱[49]。這可能是ASFV E70自然缺失了其他一些基因，而這些基因可以補(bǔ)償DP71L的缺失所造成的影響。

ASFV可通過多種機(jī)制抑制感染細(xì)胞的凋亡，但是在感染的后期可以觀察到被感染細(xì)胞的凋亡。通過這種方式促進(jìn)病毒在凋亡小體中的擴(kuò)散和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞吞噬病毒，從而避免被感染細(xì)胞的壞死引起的炎癥反應(yīng)。在體內(nèi)也可觀察到受感染的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的凋亡。急性ASF的主要特征是引起淋巴組織和血液中未受病毒感染的B、T淋巴細(xì)胞大量凋亡。初級(jí)和次級(jí)淋巴器官中的淋巴細(xì)胞消耗以及非淋巴器官(例如肝和腎)中淋巴細(xì)胞的死亡均歸因于淋巴細(xì)胞的大量凋亡，但是誘導(dǎo)未感染淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制還不清楚[50-52]。被感染的巨噬細(xì)胞周圍淋巴細(xì)胞強(qiáng)烈凋亡，這表明被感染的細(xì)胞可能分泌或細(xì)胞表面表達(dá)某些因子，從而誘導(dǎo)未感染的淋巴細(xì)胞凋亡，TNF-α就是一種可能的參與因子[18,53]。由凋亡引起的淋巴細(xì)胞的大量死亡可能也是免疫抑制的一種機(jī)制，有利于ASFV在體內(nèi)復(fù)制。

4 ASFV與炎癥反應(yīng)

ASFV可以抑制巨噬細(xì)胞M1極化，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)。研究人員通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，弱毒株E75CV1調(diào)節(jié)了涉及宿主炎癥反應(yīng)的多個(gè)蛋白的表達(dá)[54]。ASFV的A238L蛋白與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的抑制物I-κB具有相似的結(jié)構(gòu)，因此A238L蛋白可以抑制NF-κB的活化，從而抑制NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[55]。A238L蛋白還能夠結(jié)合鈣調(diào)蛋白磷酸脂酶(CaN)并抑制其作用，從而抑制了活化T細(xì)胞核因子(NFAT)活化[20]，進(jìn)而抑制宿主的炎癥反應(yīng)[56]。A238L在感染了ASFV的Vero細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中可有效地抑制TNF-α的產(chǎn)生，說明A238L蛋白是一種強(qiáng)效的抗炎蛋白[57-58]。研究人員應(yīng)用酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ASFV的I83L蛋白能與IL-1β結(jié)合，并且預(yù)測I83L蛋白可能在調(diào)控IL-1β促炎活性方面起作用[59]。

5 ASFV與天然免疫細(xì)胞

自然殺傷細(xì)胞(NK cell)是先天免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞組成成分，能夠殺死感染了病原體的細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞，是IFN-γ和TNF-α的重要來源[60]。研究人員將感染ASFV NH/P68的豬與未感染的對照組相比，發(fā)現(xiàn)感染后7 d豬的NK細(xì)胞活性明顯增加，而在感染后7～28 d，沒有臨床癥狀的接毒豬NK細(xì)胞水平顯著性增高。試驗(yàn)中無臨床癥狀的豬能夠經(jīng)得住ASFV Lisbon 60致死性攻擊。這一結(jié)果表明，NK細(xì)胞的激活能夠減輕ASFV分離株引起的臨床癥狀，有效誘導(dǎo)保護(hù)性免疫[61]。相反，接種中等毒力Malta 78 ASFV分離株的6頭豬中，有4頭豬在接毒后3～6 d NK細(xì)胞活性出現(xiàn)明顯抑制[62]。令人感興趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)，在體外40℃培養(yǎng)時(shí)，NK細(xì)胞活性喪失，因此，豬患ASF后，體溫升高可能是NK細(xì)胞活性降低的原因。另一方面， ASFV在體外可以抑制NK細(xì)胞的活性[63]。NK細(xì)胞的活性有可能與ASFV的毒力相關(guān)，因?yàn)閺慕】地i體內(nèi)分離的外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)中的NK細(xì)胞活性可被無毒的NH/P68 ASFV激活，但被有毒的Lisbon 60 ASFV抑制[64]。綜上所述，NK細(xì)胞至少能夠?qū)Ψ侵虏⌒訟SFV做出有效地反應(yīng)。

ASFV主要的靶細(xì)胞是單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，但也可以感染樹突狀細(xì)胞(DC)等抗原呈遞細(xì)胞并在其中復(fù)制。有研究表明，將豬的γδ T細(xì)胞與ASFV共同孵育后，γδT細(xì)胞可將ASFV遞呈給特異性T細(xì)胞[65]。豬γδT細(xì)胞可以分泌IFN-γ等細(xì)胞因子和趨化因子，可能在ASFV感染過程中發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[65]。

6 小結(jié)與展望

ASF對于家豬和野豬是一種毀滅性的疾病，目前還沒有商用疫苗預(yù)防該病。雖然在ASFV與宿主的相互作用以及逃避宿主免疫反應(yīng)研究方面已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但仍有許多問題需要深入研究。關(guān)于樹突狀細(xì)胞感染在發(fā)病和免疫反應(yīng)中的潛在作用，目前尚缺乏資料。非易感細(xì)胞的感染障礙也不清楚。ASFV蛋白質(zhì)組圖譜繪制成功后，為進(jìn)一步研究病毒和宿主相互作用奠定了基礎(chǔ)，這將為研發(fā)疫苗或發(fā)展其他控制感染策略提供更多的幫助。

ASFV與宿主天然免疫系統(tǒng)的相互作用過程相當(dāng)復(fù)雜，隨著研究的深入，人們對宿主抗ASFV機(jī)理和ASFV如何逃避宿主天然免疫系統(tǒng)防御有了一些認(rèn)識(shí)，但宿主抗ASFV天然免疫反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還未完全闡述清晰。ASFV基因組左右可變區(qū)內(nèi)存在大量屬于不同多基因家族(MGFs)的基因，其中MGF360和MGF505/530已被證明是ASFV毒力決定因素，并通過抑制Ⅰ型IFN誘導(dǎo)或Ⅱ型IFN反應(yīng)發(fā)揮作用(表1)。然而，這些蛋白的作用機(jī)制還不清楚，單個(gè)基因的功能還不明了。此外，I329L作為TLR3信號(hào)的激動(dòng)劑，需要進(jìn)一步研究其在感染細(xì)胞和宿主的作用機(jī)制。目前，A179L已被證明是ASFV抑制細(xì)胞凋亡的一個(gè)主要基因，但還沒有獲得刪除A179 L基因的重組病毒，以確定其抑制凋亡的機(jī)理，這些都需要進(jìn)行深入、系統(tǒng)的探究，從而為開發(fā)疫苗和抗病藥物提供新的思路和策略。

表1 ASFV基因在調(diào)控宿主天然免疫系統(tǒng)中的功能