荔波唇柱苣苔抗寒性因子分析及影響評(píng)價(jià)*

李從瑞，楊加文，湯升虎，舒啟瓊

(1貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2貴州省植物園，貴州 貴陽(yáng) 550000；3貴州師范大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550001)

0 引言

荔波唇柱苣苔(Chiritaliboensis)，苦苣苔科唇柱苣苔屬植物，分布范圍狹小，僅生長(zhǎng)在貴州荔波海拔約400 m處。荔波唇柱苣苔是多年生草本植物，根狀莖短，葉片革質(zhì)或薄革質(zhì)呈橢圓形，葉面有輻射狀白色紋理，葉色呈深綠色，花冠藍(lán)紫色，色彩艷麗，因而極具觀賞價(jià)值[1-3]。

近年來(lái)，苦苣苔科植物作為觀賞植物變得流行，但多來(lái)源于野生環(huán)境，大多數(shù)對(duì)于苦苣苔科的研究都集中在苦苣苔科植物的分類與分布方面[2]。侯娜等通過(guò)對(duì)荔波唇柱苣苔葉片離體不定芽進(jìn)行組織培養(yǎng)，建立其植株再生體系，使得其規(guī)模化生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)可能[3，5]。玉屏等人也通過(guò)荔波唇柱苣苔的種子建立了植株快繁體系[7]。目前關(guān)于荔波唇柱苣苔的抗逆性研究極少，付莉等對(duì)荔波唇柱苣苔的黑斑病防治進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)多抗霉素1000倍液能有效抑制黑斑病病菌[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，苦苣苔科植物適宜生長(zhǎng)在溫和多雨的春季，不耐高溫嚴(yán)寒[6，8]。因此探清低溫脅迫對(duì)荔波唇柱苣苔的影響機(jī)制，將為其人工栽培、優(yōu)化改良品種提供理論參考。對(duì)于植物抗寒性鑒定的方法當(dāng)前用得最多的是電導(dǎo)率測(cè)定法和生理指標(biāo)測(cè)定法，本研究擬選用生理指標(biāo)測(cè)定法對(duì)不同溫度脅迫下的苦苣苔進(jìn)行可溶性糖、可溶性蛋白等生理指標(biāo)的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：本試驗(yàn)所選用的荔波唇柱苣苔均為組培植物。

儀器藥品：人工氣候箱(BIC-400，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)、試劑盒及各種測(cè)定生理指標(biāo)的化學(xué)試劑。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)將組培苗室溫種植于10 cm×10 cm的塑料缽，待植株相對(duì)健碩后進(jìn)行抗寒性測(cè)定。將低溫脅迫設(shè)置4個(gè)梯度，分別為T(mén)4(0 ℃，重度脅迫)、T3(5 ℃，中度脅迫)、T2(10 ℃，輕度脅迫)、T1(15 ℃，冬季平均溫度)，25 ℃為常溫對(duì)照(CK)，每組溫度設(shè)置3個(gè)平行。將苦苣苔分批(按溫度劃分)放入低溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周(期間定時(shí)定量澆水)后，測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定及方法

游離脯氨酸(Pro)含量、可溶性蛋白質(zhì)(SP)、可溶性糖(SS)測(cè)定分別參照王學(xué)奎的酸性茚三酮比色法、考馬斯亮藍(lán)G-250法、蒽酮比色法[11]；超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定：采用植物組織銅鋅-超氧化物歧化酶活性測(cè)定試劑盒；過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定：采用過(guò)氧化物酶活性測(cè)定試劑盒；過(guò)氧化氫(CAT)活性測(cè)定：參照湯紹虎和羅充分光光度法[12]；丙二醛(MDA)活性測(cè)定：采用丙二醛(MDA)活性測(cè)定試劑盒；抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性測(cè)定：采用抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性測(cè)定試劑盒[9]。以上所采用的試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)荔波唇柱苣苔滲透調(diào)節(jié)物的影響

荔波唇柱苣苔的滲透調(diào)節(jié)物可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)和脯氨酸(Pro)在低溫脅迫的過(guò)程中呈上升的趨勢(shì)。隨著低溫脅迫逐漸加重，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量逐漸增加，且各滲透調(diào)節(jié)物增加趨勢(shì)各不相同。在0 ℃脅迫下，可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量達(dá)到最大值(表1)。SP含量比CK組高出3.86 mg/g，SS含量約是CK組的12倍，Pro含量是CK組的12倍。15 ℃以后，溫度每降低5 ℃，脯氨酸含量增加200 μg/g。

表1 低溫脅迫下荔波唇柱苣苔滲透調(diào)節(jié)物的含量Tab.1 Content of osmotic regulators in Chirita liboensis under low temperature stress

2.2 低溫脅迫對(duì)荔波唇柱苣苔丙二醛(MDA)含量的影響

丙二醛(MDA)作為膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，它的產(chǎn)生加劇了膜的損傷。因此可通過(guò)測(cè)定其含量了解膜系統(tǒng)受損程度及植物的抗逆性。

如圖1所示，MDA含量隨著溫度逐漸降低呈先上升而后降低的趨勢(shì)，當(dāng)脅迫溫度達(dá)到5 ℃(中度脅迫)時(shí)，MDA含量達(dá)到峰值，為4.78 nmol/mg，是CK組的4倍。當(dāng)脅迫繼續(xù)增加，MDA含量呈下降趨勢(shì)，可能是由于溫度過(guò)低使得酶活性降低，導(dǎo)致MDA含量也降低。

圖1 低溫脅迫下荔波唇柱苣苔MDA的含量Fig.1 MDA content in Chirita liboensis under low temperature stress

2.3 低溫脅迫對(duì)荔波唇柱苣苔抗氧化物酶活性的影響

SOD是植物抗逆性很重要的一種酶，它通過(guò)與植物細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽過(guò)氧酶、過(guò)氧化氫酶結(jié)合，把自由基轉(zhuǎn)化為水和氧分子，從而有效清除植物體內(nèi)的活性氧。隨著低溫脅迫程度的增加，荔波唇柱苣苔的SOD活性表現(xiàn)為先升后降，在10 ℃時(shí)顯著增加，達(dá)到最大值1225.54 U/g，溫度持續(xù)降低以后，SOD活性也隨著降低，但始終高于CK值(表2)。

表2 低溫脅迫下荔波唇柱苣苔抗氧化物酶的活性Tab.2 Activity of antioxidant enzymes in Chirita liboensis under low temperature stress

隨著低溫脅迫的加重，荔波唇柱苣苔的POD活性變化規(guī)律為先升后降再升再降的波動(dòng)，在5 ℃時(shí)活性最強(qiáng)，為55.12 U/g，0 ℃時(shí)活性最弱，為40.38 U/g，此時(shí)植株遭受低溫傷害嚴(yán)重。

隨著溫度逐漸降低，荔波唇柱苣苔的CAT活性變化為先上升再下降再上升的趨勢(shì)，10 ℃時(shí)，CAT活性最強(qiáng)，為971.74 U/g。10 ℃以后，CAT依然保持高于CK組2倍的活性。

荔波唇柱苣苔的APX活性隨低溫脅迫的加重，呈現(xiàn)出與其SOD活性相同的變化趨勢(shì)，溫度下降到10 ℃時(shí)，APX活性達(dá)到峰值，為3.79 U/g，隨后開(kāi)始降低，但高于CK值。

2.4 荔波唇柱苣苔在不同低溫脅迫下的表型變化

低溫作為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，對(duì)于荔波唇柱苣苔植株表型變化起著重要影響。通過(guò)對(duì)荔波唇柱苣苔在不同低溫脅迫下的表型觀察，能夠直觀反映出其在低溫脅迫下的受損情況。如圖2所示，荔波唇柱苣苔植株在CK條件下長(zhǎng)勢(shì)較好，葉片健康，葉色翠綠飽滿，當(dāng)溫度降到T1時(shí)，植株受到輕微損傷，葉邊緣出現(xiàn)少許壞死發(fā)黑，植株整體長(zhǎng)勢(shì)良好，在T2(輕度脅迫)溫度下，植株葉片出現(xiàn)較大面積的損傷，輕微癱軟；當(dāng)植株受到中度(5 ℃)脅迫時(shí)，表現(xiàn)出嚴(yán)重?fù)p傷，葉片整體癱軟，葉邊緣出現(xiàn)較大面積發(fā)黑；重度脅迫(0 ℃)下，植株直接死亡，表明荔波唇柱苣苔是不耐低溫植物。

圖2 低溫脅迫下的荔波唇柱苣苔表型圖Fig.2 Phenotype of Chirita liboensis under low temperature stress

2.5 對(duì)荔波唇柱苣苔抗寒相關(guān)性綜合評(píng)價(jià)

由表3可知，隨著低溫脅迫的逐漸加重，荔波唇柱苦苣苔的滲透調(diào)節(jié)物(SP、SS、Pro)的脅迫系數(shù)也逐漸增加，都在T4溫度下達(dá)到最大值，但增加幅度不同。SP在不同溫度梯度下，增加幅度較小，增加量較少，SP含量與低溫脅迫呈正相關(guān)。SS和Pro在T2至T3中驟增，增加量分別為4.36和1.78，SS和Pro含量與低溫脅迫呈顯著負(fù)相關(guān)。MDA的低溫脅迫系數(shù)隨溫度降低呈先升高后降低的趨勢(shì)，在T1至T2中增加較快，T2至T3中增長(zhǎng)較為平緩，T3至T4中開(kāi)始下降，與低溫脅迫呈正相關(guān)。荔波唇柱苣苔的抗氧化酶活性系數(shù)隨溫度梯度變化呈不同的變化方式，SOD、POD、APX脅迫系數(shù)隨溫度降低先增加后降低，分別在T2、T3、T4處理下達(dá)到最大值1.60、1.25、10.63，CAT脅迫系數(shù)隨溫度梯度先上升后下降再上升再下降，在T2達(dá)最大值，為2.20。荔波唇柱苣苔的抗氧化物酶活性中，SOD和CAT與低溫脅迫呈正相關(guān)，而POD和APX酶活性與低溫脅迫呈負(fù)相關(guān)。

表3 荔波唇柱苣苔各生理指標(biāo)脅迫系數(shù)與低溫脅迫的相關(guān)性Tab.3 Correlation between stress coefficients of physiological indexes of Chirita liboensis and low temperature stress

3 討論與結(jié)論

溫度作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用，不適宜的溫度使得植物受到低溫傷害?；跍囟群椭参锷頇C(jī)制的不同，低溫傷害分為冷害(0～20 ℃)和凍害(<0 ℃)[13，15]。冷害發(fā)生時(shí)，植物細(xì)胞內(nèi)的水分子未結(jié)冰，一些植物遭受低溫傷害后能夠通過(guò)氣溫回升而恢復(fù)正常生長(zhǎng)。凍害發(fā)生時(shí)，植物體內(nèi)發(fā)生結(jié)冰現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞而影響正常代謝造成凍害或直接死亡[10]。植物遭受低溫傷害的直接原因是毒性代謝物(活性氧等)的產(chǎn)生和積累，植物組織內(nèi)膜改變以及膜結(jié)合的酶活性增加，正常酶促反應(yīng)失調(diào)引起代謝紊亂。同時(shí)冷害誘導(dǎo)植物產(chǎn)生光抑制現(xiàn)象，導(dǎo)致光合功能下降，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[14]。

3.1 荔波唇柱苣苔能夠通過(guò)滲透調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)低溫環(huán)境

當(dāng)荔波唇柱苣苔遭受低溫脅迫時(shí)，隨著溫度的逐漸降低，其SP、SS、Pro含量也逐漸增加，表明荔波唇柱苣苔能夠通過(guò)滲透調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)低溫環(huán)境。丙二醛(MDA)是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，被作為植物抗逆性相關(guān)的因素。隨著溫度逐漸下降，MDA的含量一直上升，遭受重度脅迫時(shí)，含量開(kāi)始降低，可能是由于相關(guān)酶活性降低的原因。

遭受低溫脅迫時(shí)，在輕中度脅迫下，荔波唇柱苣苔的SOD、POD、CAT、APX活性都呈上升趨勢(shì)，當(dāng)脅迫程度進(jìn)一步加深，酶活性則因?yàn)闇囟冗^(guò)低而使得活性降低，植物抵御寒冷的能力也隨之降低。

3.2 荔波唇柱苣苔植株在5 ℃脅迫下受到嚴(yán)重?fù)p傷

荔波唇柱苣苔遭受低溫脅迫時(shí)，它的滲透系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)都能在一定程度上抵御低溫傷害，但當(dāng)脅迫程度進(jìn)一步加重時(shí)，抗氧化酶活性降低使得活性氧大量積累，造成質(zhì)膜損傷，使得植物受到凍害。在低溫脅迫從15 ℃加重到10 ℃時(shí)，荔波唇柱苣苔的滲透調(diào)節(jié)物、MDA和抗氧化物酶活性都呈倍數(shù)增加，說(shuō)明此時(shí)植株的生理脅迫響應(yīng)最強(qiáng)。當(dāng)脅迫溫度下降到5 ℃時(shí)，荔波唇柱苣苔植株的丙二醛(MDA)含量積累到最大值，對(duì)植株損傷最大，同時(shí)對(duì)植株起保護(hù)作用的酶(SOD、CAT、APX)活性降低，保護(hù)作用下降，此時(shí)植株的抗寒能力達(dá)到臨界值，若溫度繼續(xù)下降，將對(duì)植物造成傷害而不能恢復(fù)正常。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺少唇柱苣苔的形態(tài)指標(biāo)，同時(shí)盆栽實(shí)驗(yàn)存在少土等不利因素，限制了植株生長(zhǎng)而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精確性，對(duì)于荔波唇柱苣苔的綜合抗寒性還需結(jié)合田間實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可對(duì)進(jìn)一步的抗寒性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。