孫志鵬，武華衛(wèi)，方 穎，賴世會，羅建勛

(四川省林業(yè)科學研究院，成都 610081)

油用牡丹(PaeoniasufruticosaAndr．)是中國獨有的原生多年生小灌木，是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(PaeoniaL.)牡丹組中結(jié)實能力強并能用來生產(chǎn)種籽、加工食用牡丹籽油的牡丹類型[1-3]。作為中國新興的油料作物，油用牡丹籽含油率在20%以上，不飽和脂肪酸含量高達92%以上(其中α-亞麻酸占42%)，多項指標超過被稱為“液體黃金”的橄欖油，經(jīng)濟價值極高[4-5]。目前，油用牡丹主要以‘鳳丹’(Paeoniaostii)和‘紫斑牡丹’(P．rockii)兩大品種群為栽培材料[6]，其中‘鳳丹’是由楊山牡丹(PaeoniaostiaT. Hong et J. X. Zhang)經(jīng)栽培演化形成的品種亞群，具耐濕熱、適生性強和結(jié)實率高等特點，兼具觀賞、藥用和油用價值[7-8]。近年來，因其含油量高、油質(zhì)好等特點，全國范圍內(nèi)‘鳳丹’被越來越多省份引種栽植。四川省自2011年開始引種，現(xiàn)主要分布于成都、綿陽、樂山、巴中、達州、遂寧、南充、巴中、涼山州布拖、鹽源以及阿壩州金川縣等地。

目前，四川‘鳳丹’產(chǎn)業(yè)發(fā)展還處于起步階段，理論及實踐經(jīng)驗不足，尚未形成適宜四川地區(qū)氣候條件的系統(tǒng)栽培繁育技術(shù)體系；同時，受各種植區(qū)氣候和土壤環(huán)境等自然因素影響，‘鳳丹’種子營養(yǎng)成分含量差異較大。已有研究表明，環(huán)境生態(tài)因子對種子中營養(yǎng)成分的累積具有重要影響，適宜的生態(tài)環(huán)境條件有利于種子優(yōu)良品質(zhì)的形成[9-11]。目前，對于油用牡丹的研究多集中于育種栽培[12-13]、牡丹籽油的成分分析[14-15]及牡丹籽油的提取方法[16-17]等方面，關(guān)于不同生態(tài)環(huán)境下‘鳳丹’種子營養(yǎng)成分含量差異及其與生態(tài)因子的耦合關(guān)系尚缺乏深入系統(tǒng)探討。因此，研究‘鳳丹’種子中營養(yǎng)成分的累積與生態(tài)因子的關(guān)系對生產(chǎn)實踐具有重要指導意義。本研究以四川盆地引種的‘鳳丹’種子為試驗材料，進行表型性狀和營養(yǎng)成分對比分析，并基于氣象、土壤養(yǎng)分和海拔等生態(tài)因子，探討各營養(yǎng)成分與生態(tài)因子的相關(guān)性，揭示影響種子主要營養(yǎng)成分的關(guān)鍵因子，以期為四川‘鳳丹’科學栽培、高效生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 采樣地概況

本次試驗種子采集于四川盆地內(nèi)的12個‘鳳丹’種植基地，包括巴中地區(qū)(南江縣和恩陽區(qū))、綿陽地區(qū)(梓潼縣和游仙區(qū))、成都地區(qū)(大邑縣和崇州市)、樂山地區(qū)(峨邊縣和沐川縣)、達州地區(qū)(達川區(qū)和宣漢縣)以及遂寧地區(qū)(蓬溪縣)。用手持GPS測定樣地的經(jīng)緯度和海拔，登錄中國氣象科學數(shù)據(jù)共享服務(wù)網(wǎng)查詢系統(tǒng)(http://data.cma.cn)，獲取平均降水量、日照時數(shù)、年均溫、1月均溫、7月均溫和年均相對濕度。各采樣地環(huán)境生態(tài)因子見表1。

1.2 試驗材料

2020年8月，分別在12個‘鳳丹’種植基地采集樣品。每個采樣地選擇生長良好、果實發(fā)育正常的植株，采用對角線法選取20株進行球果采集，球果取回后，在實驗室自然晾干，剝?nèi)》N子，備用。采集‘鳳丹’球果的同時采集土壤樣品，在每個采樣地的東、西、南、北4個方位分別采集0～20 cm土層的土壤，用四分法縮分，去除雜質(zhì)后，裝于自封袋中，帶回實驗室自然風干，備用。

表1 采樣地的立地氣候和土壤條件

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 種子表型性狀千粒重采用四分法，隨機選取100粒種子，用測量精度為0.01 g的電子天平稱量；種子橫徑為與種柄延伸方向垂直的最大測量值，種子縱徑為與種柄延伸方向一致的種子大小測量值，用測量精度均為0.01 mm的游標卡尺測定，并據(jù)此計算種形指數(shù)(種形指數(shù)=種子縱徑/種子橫徑)。

1.3.2 種子營養(yǎng)成分①采用索氏抽提法測定種仁中的含油量，按照GB/T 14488.1-2008[18]進行測定。

②采用半微量凱氏定氮法測定種仁中的蛋白質(zhì)含量，按照GB/T 5009.5-2010進行測定[19]。

③采用GC-MS測定牡丹籽油中5種主要的脂肪酸(亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸)[20]相對含量，按照GB/T 17376-2008[21]和GB/T 17377-2008[22]測定。

1.3.3 土壤養(yǎng)分含量土壤pH用酸度計直接測定；土壤有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀法-外加熱法測定；土壤堿解氮含量用堿解擴散法測定；土壤有效磷含量用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀含量用中性乙酸銨浸提—原子吸收分光光度法測定[23-26]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0和Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析法檢測不同性狀在各引種地間的差異顯著性，采用Canoco5.0軟件中的冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)方法分析‘鳳丹’種子營養(yǎng)成分含量與生態(tài)因子之間的相互關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣地‘鳳丹’種子表型性狀分析

表型性狀是評價種子的重要組成部分，對衡量種子品質(zhì)的優(yōu)劣具有重要指導意義[27]。表2顯示，4個‘鳳丹’種子表型性狀橫徑、縱徑、種形指數(shù)和千粒重在12個采樣地間差異均達到極顯著水平(P<0.01)。其中，12個‘鳳丹’采樣地種子平均橫徑為9.05 mm，變幅為7.98～10.63 mm，其中樂山市峨邊縣、綿陽市游仙區(qū)、成都市崇州市均大于10 mm，綿陽市梓潼縣、達州市達川區(qū)均小于8.0 mm；各采樣地種子平均縱徑為9.32 mm，變幅為7.75～10.86 mm，巴中市南江縣、達州市宣漢縣及南充市西充縣均大于10 mm，僅成都市大邑縣小于8 mm；各采樣地種子平均種形指數(shù)為1.06，變幅為0.80～1.32，南充市西充縣、達州市宣漢縣、巴中市恩陽區(qū)和達州市達川區(qū)均大于1.20，綿陽市游仙區(qū)、成都市大邑縣、成都市崇州市和樂山市峨邊縣均小于0.90；各采樣地種子平均千粒重為348.85 g，變幅為311.23～393.15 g，其中巴中市南江縣、成都市崇州市、樂山市峨邊縣及綿陽市游仙區(qū)均超過370 g，分別是最小的巴中市恩陽區(qū)的1.26、1.19、1.23和1.23倍。另外，多重比較結(jié)果顯示：4個種子表型性狀均在3個或3個以上的引種地存在顯著差異和極顯著差異，說明這些性狀在不同采樣地間的多樣性較高；不同采樣地的種子橫徑、縱徑大小變化沒有明顯的規(guī)律性，但種形指數(shù)卻表現(xiàn)出明顯的隨著經(jīng)度的增加呈逐步增大的趨勢。通過對‘鳳丹’各表型性狀的變異系數(shù)分析可知(表2)，在‘鳳丹’4個表型性狀中，平均變異系數(shù)最大的為種形指數(shù)(17.50%)，其次為橫徑(11.39%)和縱徑(9.06%)，變異系數(shù)最小的為千粒重(8.08%)，表明千粒重的變異程度最小，而種形指數(shù)的變異程度最大。

2.2 各樣地‘鳳丹’種子營養(yǎng)成分分析

2.2.1 含油率和蛋白質(zhì)含量由圖1可以看出，各采樣地‘鳳丹’種子含油率的平均值為24.07%，變化幅度為20.5%～26.9%，超過平均值的采樣地有巴中、達州和南充地區(qū)以及樂山市沐川縣，并以樂山市沐川縣、達州市宣漢縣和巴中市南江縣的含油率最高，處于26.0%～26.9%之間，而遂寧市蓬溪縣的含油率最低，僅為20.5%。各采樣地‘鳳丹’種子蛋白質(zhì)含量的平均值為17.1%，變化幅度為15.6%～19.6%，其中綿陽市游仙區(qū)、巴中市南江縣和巴中市恩陽區(qū)的最高且均超過18%，分別為19.6%、18.3%和18.1%，而成都市大邑縣和遂寧市蓬溪縣的蛋白質(zhì)含量最低，均小于16%；巴中、南充地區(qū)‘鳳丹’種子的蛋白質(zhì)含量高低與其含油率表現(xiàn)相似，也均超過平均值，而成都地區(qū)種子蛋白質(zhì)含量高低同其含油率具有相同的規(guī)律，也均低于平均值。

2.2.2 脂肪酸含量圖2顯示，‘鳳丹’種子中5種主要脂肪酸(α-亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸)含量以α-亞麻酸較高，遠高于其他成分，也遠高于在橄欖油中含量，因此，α-亞麻酸含量在一定程度上也決定了‘鳳丹’籽油的品質(zhì)[28]。其中，不同采樣地‘鳳丹’籽油中α-亞麻酸含量存在顯著差異(P<0.05)，含量處于42.8%～47.1%之間，并以巴中市南江縣、綿陽市游仙區(qū)‘鳳丹’α-亞麻酸含量較高(>46%)，而以南充市西充縣、達州市達川區(qū)較低(<43%)；不同采樣地‘鳳丹’籽油中亞油酸含量也存在顯著差異(P<0.05)，含量處于15.7%～19.6%之間；不同采樣地‘鳳丹’籽油中棕櫚酸、硬脂酸、油酸含量差異均不顯著(P>0.05)，3種脂肪酸含量依次為5.23%～5.76%，1.66%～2.03%，19.8%～21.6%，均以綿陽市游仙區(qū)較高，分別達到5.76%、2.03%和21.3%。

表2 12個‘鳳丹’采樣地種子表型性狀

不同小寫字母表示樣地間在0.05水平存在顯著性差異 (P<0.05)圖1 12個引種地‘鳳丹’種子含油率和蛋白質(zhì)含量The different normal letters indicate the significant difference among sampling sites at 0.05 level (P<0.05)Fig.1 Oil content and protein content of seeds from 12 ‘Fengdan’ sampling sites

圖2 不同采樣地‘鳳丹’種子中主要脂肪酸成分含量Fig.2 Main fatty acid contents of ‘Fengdan’ seeds from different sampling sites

2.3 ‘鳳丹’種子各性狀相關(guān)性分析

‘鳳丹’種子性狀間的相關(guān)性分析結(jié)果(圖3)表明：千粒重與α-亞麻酸、亞油酸含量均具有極顯著相關(guān)關(guān)系，其中與α-亞麻酸呈極顯著正相關(guān)(0.760)，與亞油酸呈極顯著負相關(guān)(-0.701)；蛋白質(zhì)與亞油酸、油酸含量具有極顯著相關(guān)關(guān)系，其中與亞油酸呈極顯著負相關(guān)(-0.686)，與油酸呈極顯著正相關(guān)(0.665)；α-亞麻酸與亞油酸含量呈極顯著負相關(guān)(-0.904)；棕櫚酸與硬脂酸含量呈極顯著負相關(guān)(-0.792)。

進一步對呈顯著相關(guān)的因子進行線性回歸分析，得到‘鳳丹’種子中α-亞麻酸含量與千粒重，亞油酸含量與千粒重、蛋白質(zhì)含量和α-亞麻酸含量，油酸含量與蛋白質(zhì)含量，以及硬脂酸含量與棕櫚酸含量的回歸方程(圖 4)。這為通過千粒重直接估算α-亞麻酸和亞油酸的質(zhì)量分數(shù)以及各脂肪酸間的質(zhì)量分數(shù)估算提供便利。

2.4 不同引種地‘鳳丹’種子品質(zhì)與生態(tài)因子的關(guān)系

由表3可知，前兩個排序軸的累計解釋量達80.61%，說明排序結(jié)果可信，能較好地解釋2組變量的關(guān)系。由圖5可知，立地氣候?qū)ΑP丹’種子表型性狀和營養(yǎng)性狀具有重要影響，其中立地條件對其影響最大，貢獻率大小為速效鉀>有機質(zhì)>海拔>堿解氮>有效磷>pH；氣候條件對其的貢獻率大小為全年日照>1月均溫>7月均溫>年降雨量>年均溫。速效鉀對種形指數(shù)和油酸的影響較大，有機質(zhì)和堿解氮對蛋白質(zhì)和含油率的影響較大，海拔對種子表型性狀的影響較大；同時海拔、速效鉀、有效磷、堿解氮和溫度等立地氣候因子與種子表型性狀、蛋白質(zhì)、含油率、棕櫚酸和α-亞麻酸正相關(guān)程度大，與硬脂酸和亞油酸呈負相關(guān)。

*、**分別表示差異顯著水平為0.05和0.01。GW. 千粒重;P.含油率; pro. 蛋白質(zhì); C18∶3n3. α-亞麻酸; C18∶2n6c. 亞油酸; C16∶0.棕櫚酸; C18∶0. 硬脂酸; C18∶1n9c. 油酸圖3 ‘鳳丹’種子各性狀間相關(guān)性分析* and ** mean significant correlation between variables at 0.05 and 0.01 level. GW.1 000-grain weight; P. Oil content; pro. Protein content; C18∶3n3.α-Linolenic acid; C18∶2n6c. Linoleic acid; C16∶0. Palmitic acid; C18∶0. Stearic acid; C18∶1n9c. Oleic acidFig.3 Correlation coefficients among indexes of ‘Fengdan’ seeds

表3 種子性狀與地理氣候因子的RDA分析

圖4 ‘鳳丹’種子中顯著相關(guān)性狀間的回歸分析Fig.4 Regression analysis of significant correlation factors of ‘Fengdan’ seeds

Alt.海拔；MAT.年均溫；AT January.1月均溫；AT July.7月均溫；AAR.年降雨量；ASD.全年日照時數(shù)；PH.pH值；OM.有機質(zhì)；K.速效鉀；P.有效磷； N.堿解氮；HD.橫徑；VD.縱徑；SSI.種形指數(shù)；TKW.千粒重；OR.含油率；Pr.蛋白質(zhì)；ALA.α-亞麻酸；CLA.亞油酸；PA.棕櫚酸；SA.硬脂酸；OA.油酸圖5 ‘鳳丹’種子性狀與其立地地理氣候因子的典型相關(guān)性Alt. altitude; MAT. Annual average temperature; AT January.Average temperature of January; AT July. Average temperature of July; AAR. Annual precipitation; ASD. Annual sunshine duration; pH. pH; OM. Organic matter; K. Available K; P. Available phosphorous; N. Alkali-hydrolyzable nitrogen; HD. Iransverse diameter; VD. Longitudinal diameter; SSI. Seed shape index; TKW. Thousand-grain weight; OR, Oil content; Pr. Protein; ALA. α-Linolenic acid; CLA. Linoleic acid; PA. Palmitic acid; SA. Stearic acid; OA. Oleic acidFig.5 Canonical correlation analysis between ‘Fengdan’ seed traits and geo-meteorological factors

3 討 論

表型多樣性是遺傳多樣性和環(huán)境多樣性的綜合表現(xiàn)，對種子性狀進行差異比較和多樣性研究，可一定程度上反映該物種的遺傳變異大小，同時還能反映出形態(tài)變異對環(huán)境的適應(yīng)關(guān)系[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同采樣地‘鳳丹’種子各表型性狀均存在極顯著差異(P<0.01)，表明引種到四川盆地的‘鳳丹’會對不同生境做出差異響應(yīng)，表型性狀變化就是其形式之一[31-32]。變異系數(shù)的差異反映了不同表型性狀對環(huán)境的不同適應(yīng)能力[33]，變異系數(shù)越大，表型性狀差異越明顯，遺傳變異可能性越大。本研究中測定的表型性狀變異系數(shù)為8.08%～17.50%，說明這12個采樣地‘鳳丹’種子表現(xiàn)出較為豐富的遺傳多樣性，這與孫佳婷等[34]在臺灣欒樹(Koelreuteriaeleganssubsp.formosana)的表型遺傳多樣性評價的研究結(jié)果一致?？梢?，這些性狀在后期對育種材料進行選擇時具有較高參考價值，可作為目標評價體系中的重要指標進行觀測。其中，種形指數(shù)變異系數(shù)最大達到17.5%，而千粒重變異系數(shù)最小僅為8.08%，表明種形指數(shù)的變異水平高于千粒重性狀，千粒重受到環(huán)境的影響相對較小，更趨于穩(wěn)定。此外，本研究測定的籽油中α-亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸和油酸含量變異幅度均較小(2.57%～6.07%)，遠低于表型性狀變異系數(shù)(8.08%～17.50%)，表明表型變異強度變異明顯高于營養(yǎng)性狀變異。‘鳳丹’自四川引種以來，長期適應(yīng)不同的環(huán)境，可能導致相同的功能性狀在不同引種地間存在顯著差異。在不同的環(huán)境中，‘鳳丹’通過形態(tài)變化和表型性狀分化調(diào)整自身的生長發(fā)育及其與環(huán)境之間的關(guān)系，從而適應(yīng)環(huán)境的變化，不同采樣地種子橫徑、縱徑大小沒有明顯的規(guī)律性，說明種子大小受地理因素的影響較??；種形指數(shù)表現(xiàn)出明顯的隨經(jīng)度的增加逐步增大的規(guī)律。說明高經(jīng)度地區(qū)‘鳳丹’種子則較窄長，而低經(jīng)度地區(qū)的‘鳳丹’種子形態(tài)較寬短，可能與采樣地的經(jīng)度跨度大且涉及的種子表型性狀數(shù)量多有關(guān)。

在選擇相關(guān)性極強的性狀組時，其中一個性狀改良可同時影響其他性狀改變，可在性狀選擇上提供不同的改良方向和選擇標準[35-36]。本研究通過比較‘鳳丹’種子各性狀間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)‘鳳丹’種子含油率和蛋白質(zhì)含量與表型性狀間無顯著相關(guān)關(guān)系，證明在所選表型性狀中不能對油用優(yōu)良單株進行間接選擇；同時，本研究發(fā)現(xiàn)‘鳳丹’種子含油率和脂肪酸組分間也無顯著相關(guān)關(guān)系，而脂肪酸組分間具有不同的相關(guān)性，α-亞麻酸含量與亞油酸含量呈極顯著負相關(guān)，硬脂酸含量與棕櫚酸含量呈極顯著正相關(guān)，該結(jié)果與向婷婷等對野生油茶種子中含油率和脂肪酸組分正相關(guān)的研究結(jié)果不一致[37]，可能是由于研究區(qū)域范圍和樹種差異造成的，但要提高‘鳳丹’籽油的綜合食用價值，不能僅將含油率作為唯一參照，還要兼顧其脂肪酸組分，特別是α-亞麻酸含量等。另外，本研究中千粒重與α-亞麻酸極顯著正相關(guān)，與亞油酸呈極顯著負相關(guān)，千粒重是油用牡丹產(chǎn)量性狀和品質(zhì)指標的主要構(gòu)成因素[38]，通過線性回歸分析以及建立回歸方程，可以為通過千粒重直接估算α-亞麻酸和亞油酸的質(zhì)量分數(shù)以及各脂肪酸間的質(zhì)量分數(shù)估算提供便利。

種子表型性狀受外界多種因子的影響，如海拔、年平均氣溫和經(jīng)緯度等[39-40]。本研究發(fā)現(xiàn)土壤速效鉀、有機質(zhì)含量和海拔等立地條件因子，以及全年日照、1月均溫和7月均溫等氣候條件因子對‘鳳丹’種子表型的貢獻率較大，這是因為土壤中速效鉀和有機質(zhì)含量會影響植物種子中營養(yǎng)化學成分的積累[39]，海拔會影響不同采樣地的熱、水和土等條件的空間差異，形成復(fù)雜的生境，在經(jīng)過長期的地理隔離和自然選擇間接影響種實的表型變異幅度[41]。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)速效鉀對種形指數(shù)和油酸的影響較大，有機質(zhì)對蛋白質(zhì)和含油率的影響較大，該結(jié)果與潘苗等[42]和羅芊芊等[43]對南方紅豆杉的研究結(jié)果相近，這是因為鉀元素參與植物體內(nèi)的某些代謝反應(yīng)，具有提高含油量的作用，有機質(zhì)含量對種子中營養(yǎng)化學成分影響顯著，從而促進植物體內(nèi)有機物質(zhì)合成和積累。另外，‘鳳丹’種子絕大部分性狀與地理氣象因子的相關(guān)性表現(xiàn)出一致的趨勢，主要表現(xiàn)為與經(jīng)緯度、年平均氣溫呈正相關(guān)關(guān)系。這是因為經(jīng)緯度和海拔的梯度變化能夠綜合反映氣溫、降水和植被等環(huán)境因子的作用[44]。本研究中采樣地海拔、土壤養(yǎng)分和溫度等因子與‘鳳丹’表型性狀、蛋白質(zhì)、含油率、棕櫚酸和α-亞麻酸正相關(guān)程度較大，該結(jié)果與劉從等研究結(jié)果一致，認為植物體能夠通過形態(tài)變化和養(yǎng)分形成來適應(yīng)環(huán)境的改變，即形態(tài)可塑性[45]。出現(xiàn)這種情況一方面是受長期自然選擇影響造成的自身遺傳變異特性，另一方面是由各環(huán)境因子綜合作用造成的主要營養(yǎng)成分含量變異[46]。

綜上所述，四川盆地不同區(qū)域引種栽培的‘鳳丹’種子表型性狀及主要營養(yǎng)成分含量具有顯著差異，氣象、土壤養(yǎng)分和海拔等生態(tài)因子對‘鳳丹’種子品質(zhì)具有重要影響，在選擇‘鳳丹’種植基地時應(yīng)充分考慮各地生態(tài)因子的差異，應(yīng)選擇海拔、溫度較高，土壤養(yǎng)分(有機質(zhì)、速效鉀、有效磷、堿解氮)豐富的地區(qū)。