吉馬酮調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

何超月，任黔川

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌及子宮體癌，其早期病變一般無(wú)明顯癥狀及體征，且早期篩查缺乏敏感度，病情進(jìn)展較快，死亡率居各類婦科腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅廣大婦女生命健康[1]。目前卵巢癌的一線治療方式為先行標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)后進(jìn)行以紫杉醇和鉑類藥物為主的化療。雖然化療藥物的作用機(jī)制明確，療效顯著，但有一定的毒性及耐藥性[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)大量報(bào)道一些中藥治療卵巢癌具有多靶點(diǎn)、多途徑、不良反應(yīng)小、經(jīng)濟(jì)有效等優(yōu)勢(shì)[3-4]，吉馬酮是從莪術(shù)中提取的一種單環(huán)倍半萜類天然化合物，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用[5-6]。本文主要研究吉馬酮對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響及其作用機(jī)制，以期為研究吉馬酮治療卵巢癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 吉馬酮(上海源葉生物，貨號(hào)B20589)分子式C15H22O，規(guī)格20 mg，純度HPCL ≥ 98%。二甲基亞砜(DMSO)溶解吉馬酮，并經(jīng)直徑0.22 μm除菌濾器過(guò)濾分裝后作為母液，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。人卵巢癌SKOV3細(xì)胞(第4代，由西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供)；人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE-80(第4代，廣州佰匯生物，貨號(hào)FH1132)。McCoy’5A培養(yǎng)基(普諾賽，貨號(hào)PM150710)，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，貨號(hào)c11875500bt)，胎牛血清(杭州四季青，貨號(hào)11011-8611)，CCK8試劑盒(同仁化學(xué)，貨號(hào)CK04)，Transwell小室(康寧，貨號(hào)P0012)，基質(zhì)膠(康寧，貨號(hào)356234)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天，貨號(hào)P0012)，ECL發(fā)光液(葆光生物，貨號(hào)GB0001)，兔抗人JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、MMP2、MMP9抗體(萬(wàn)類生物，貨號(hào)WL01836)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(萬(wàn)類生物，貨號(hào)WLA023)。超凈工作臺(tái)，酶標(biāo)儀，倒置相差顯微鏡，BIO-RAD垂直電泳儀等。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)于McCoy’5A培養(yǎng)基(含1%青霉素-鏈霉素雙抗，10%胎牛血清)，將人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE-80培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(含1%青霉素-鏈霉素雙抗，10%胎牛血清)，37℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞 生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 設(shè)置濃度70 μmol/L、140 μmol/L、210 μmol/L、280 μmol/L、350 μmol/L吉馬酮組，對(duì)照組(0 μmol/L)和空白對(duì)照組(無(wú)卵巢癌SKOV3細(xì)胞、正常卵巢IOSE-80細(xì)胞)。取呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞及IOSE-80細(xì)胞，分別用相應(yīng)的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后更換為完全培養(yǎng)基配置的各個(gè)濃度吉馬酮溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。棄培養(yǎng)基，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μL及CCK8試劑10 μL，放入孵箱孵育0.5 h、1 h、2 h和4 h后分別檢測(cè)OD值。發(fā)現(xiàn)在2 h時(shí)測(cè)得的OD值大小適宜，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取2 h作為測(cè)定時(shí)間點(diǎn)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度(OD值)，計(jì)算細(xì)胞抑制率。根據(jù)CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇0 μmol/L、1 40 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4 細(xì) 胞 劃 痕 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 置 濃 度140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮組，對(duì)照組吉馬酮濃度0 μmol/L，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在12孔板的背面劃5條相互平行的直線，橫行穿過(guò)培養(yǎng)孔，每根直線距離約為0.5 cm。接種SKOV3細(xì)胞于12孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜使細(xì)胞貼壁。棄舊培養(yǎng)基，以0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮處理細(xì)胞24 h，用200 μL槍頭在孔底垂直劃線，用PBS清洗掉被劃下的細(xì)胞，加入含2%FBS培養(yǎng)基，拍照記錄此時(shí)的劃痕面積。將12孔板置于孵箱中再培養(yǎng)24 h，再次拍照記錄劃痕面積 ，并計(jì)算劃痕愈合率。

5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞種植于6孔板，每孔2×105個(gè)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)基，分別以0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮處理細(xì)胞24 h，收集藥物處理后的細(xì)胞，無(wú)血清McCoy’5A培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)至2×105/mL。取24孔板配套Transwell小室，24孔板中加入含20% FBS培養(yǎng)基700 μL，放入Transwell小室，1 h后分別加入200 μL各組細(xì)胞懸液至Transwell上室，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS輕柔清洗1次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌2次，1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗去多余結(jié)晶紫，用棉簽輕輕擦去上室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，晾干用顯微鏡下拍照(100×)計(jì)數(shù)，同一倍鏡選取5 個(gè)不同視野細(xì)胞數(shù)取平均值。

6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞處理方式同5，將基質(zhì)膠(Matrigel)在4℃提前1天融化，Transwell小室、24孔培養(yǎng)板、槍頭置于-20℃冰箱過(guò)夜預(yù)冷。用新鮮培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠(冰上操作)，將4℃預(yù)冷的含20% FBS的McCoy’5A培養(yǎng)基加入24孔板中，每孔700 μL，放入Transwell小室(避免產(chǎn)生氣泡)，加入100 μL基質(zhì)膠于Transwell上室底部，置于37℃孵箱4～5 h，基質(zhì)膠聚成后取出24孔板，加入100 μL單純培養(yǎng)基水化30 min，分別加入各組細(xì)胞200 μL于Tanswell上室培養(yǎng)24 h，后 續(xù)步驟同5。

7 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白 以濃度0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮處理細(xì)胞24 h，棄去舊培養(yǎng)基，4℃預(yù)冷PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制劑(PMSF)的裂解液裂解30 min，收集裂各組細(xì)胞解液，超聲機(jī)粉碎，4℃ 12 000 r/min下離心15 min，收集上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度后將各組蛋白濃度調(diào)整一致，加入5×上樣緩沖液，100℃金屬浴15 min。制膠，每孔上樣15 μL，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h后置于一抗孵育液中，4℃搖床孵育過(guò)夜。PBST洗膜3次，放入HRP山羊抗兔二抗中孵育1 h。PBST洗膜3次，滴加適量ECL發(fā)光液曝光分 析。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以 xˉ±s表示，CCK8中不同濃度、不同時(shí)間下吉馬酮對(duì)SKOV3細(xì)胞的影響采用多因素方差分析，其余多組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢 驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 吉馬酮對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響 不同濃度的吉馬酮作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞及正常卵巢IOSE-80細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，結(jié)果顯示，同一濃度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，SKOV3細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加，呈時(shí)間依賴性，但當(dāng)吉馬酮濃度為70 μmol/L、140 μmol/L時(shí)，24 h和48 h的SKOV3細(xì)胞抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；相同時(shí)間下，各濃度吉馬酮對(duì)SKOV3細(xì)胞抑制率均顯著增高(P＜0.05)，呈濃度依賴性。在相同濃度及作用時(shí)間下，吉馬酮對(duì)正常卵巢IOSE-80細(xì)胞的增殖抑制作用明顯低于卵巢癌SKOV3細(xì)胞(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。吉馬酮作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞及正常卵巢IOSE-80細(xì)胞24 h的IC50分別為3 64.7 μmol/L、1 661.0 μmol/L。

圖1 不同濃度吉馬酮作用24 h、48 h、72 h時(shí)SKOV3細(xì)胞增殖抑制率(A) (aP＜0.05, vs 70 μmol/L 24 h; bP＜0.05, vs 70 μmol/L 48 h;cP＜0.05, vs 70 mmol/L 72 h)、SKOV3細(xì)胞與IOSE-80細(xì)胞的增殖抑制率(B) (aP＜0.05, vs SKOV3, 70 μmol/L; bP＜0.05, vs IOSE-80,70 μmol/L; cP＜0.05, vs SKOV3)Fig.1 Proliferation inhibition ratio of SKOV3 cells (A. aP＜0.05, vs 70 μmol/L, 24 h; bP＜0.05, vs 70 μmol/L, 48 h; cP＜0.05, vs 70 mmol/L,72 h), SKOV3 cells and IOSE-80 cells treated with different concentrations of germacrone at 24 h, 48 h and 72 h (B. aP＜0.05, vs SKOV3, 70 μmol/L; bP＜0.05, vs IOSE-80, 70 mmol/L; cP＜0.05, vs SKOV3)

2 吉馬酮對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移能力的影響 濃度0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮組細(xì)胞劃痕愈合率分別為69.00% ± 6.76%、40.33% ± 5.21%、13.79% ± 9.23%，藥物組與對(duì)照組相比，細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tanswell遷移實(shí)驗(yàn)中濃度0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L的吉馬酮組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)分別為466.5 ± 47.7、319.4 ± 41.2、149.7 ± 26.3。藥物組與對(duì)照組相比，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，呈濃度依賴性，見(jiàn)圖2。說(shuō)明吉馬酮能減 弱SKOV3細(xì)胞遷移能力。

圖2 吉馬酮對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移能力的影響A：細(xì)胞劃痕圖片(40 ×)；B：細(xì)胞遷移圖片(100 ×)；C：細(xì)胞劃痕統(tǒng)計(jì)圖；D：細(xì)胞遷移統(tǒng)計(jì)圖(aP＜0.05，vs 0 μmol/L)Fig.2 Effect of germacrone on the migration of SKOV3 cellsA: Images of cell scratch assay (40 ×); B: Images of cell migration (100 ×); C: Statistical analysis of cell scratch assay; D: Statistical analysis of cell migration (aP＜0.05, vs 0 μmol/L)

3 吉 馬 酮 對(duì)SKOV3細(xì) 胞 侵 襲 能 力 的 影 響 0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L在Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)中，吉馬酮組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)分別為278.6 ± 71.8、161.0 ± 35.4、70.1 ± 24.9。藥物組與對(duì)照組相比，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，呈濃度依賴性，見(jiàn)圖3。說(shuō)明吉馬酮可減弱細(xì) 胞侵襲能力。

圖3 吉馬酮對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響A：細(xì)胞侵襲圖片(100 ×)；B：細(xì)胞侵襲統(tǒng)計(jì)圖(aP＜0.05，vs 0 μmol/L)Fig.3 Effect of germacrone on the invasion of SKOV3 cellsA:Images of cell invasion (100 ×); B: Statistical analysis of cell invasion (aP＜0.05, vs 0 μmol/L)

4 Western blot法 檢 測(cè)JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、MMP2、MMP9蛋白表達(dá) 0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮處理SKOV3細(xì)胞24 h后各組細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，組間兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。p-JAK2、p-STAT3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、MMP2、MMP9差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0,05)，對(duì)照組最高，140 μmol/L吉馬酮組次之，280 μmol/L吉馬酮組最低，組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1，圖4及圖5。

圖5 各組細(xì)胞蛋白MMP2、MMP9蛋白表達(dá)(aP＜0.05, vs0 μmol/L)Fig.5 Comparison of MMP2, MMP9 protein expressions between each group (aP＜0.05, vs 0 μmol/L)

表1 不同濃度吉馬酮處理SKOV3細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較Tab. 1 Expressions of signaling pathway related proteins in SKOV3 cells treated with different concentrations of germacrone

圖4 各組細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)比較(aP＜0.05，vs 0 μmol/L)Fig.4 Comparison of p-JAK2, p-STAT3, p-JAK2/JAK2, p-STAT3/STAT3 protein expressions between each group (aP＜0.05, vs 0 μmol/L)

討 論

中藥因在抗腫瘤方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)有關(guān)中藥抗卵巢癌的研究熱點(diǎn)逐漸增加。研究報(bào)道，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，吉馬酮對(duì)肝癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌、人慢性粒細(xì)胞白血病、宮頸癌細(xì)胞均有抑制作用[7-14]。其抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)涉及多個(gè)靶點(diǎn)，如吉馬酮可通過(guò)抑制JAK2/STAT3通路、調(diào)節(jié)PTEN-AKT通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖[8]；可抑制周期蛋白CyclinB1、CyclinA及周期蛋白依賴性激酶CDK1表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G2/M周期阻滯[7]；吉馬酮可通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白BAX，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2促進(jìn)肺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞凋亡[15-16]；可調(diào)控hbxion介導(dǎo)的細(xì)胞周期、凋亡，促進(jìn)自噬體形成，抑制胃癌細(xì)胞增殖[13]；可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[11]；可抑制MMP9表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞的遷移[12]；可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞、人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，增加其化療敏感度等[17-19]。

JAKs家族JAK是一類重要的酪氨酸激酶，由JAK1、JAK2、JAK3和TYK1四個(gè)成員構(gòu)成。JAK的下游信號(hào)是STAT，有STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6七個(gè)成員。其中JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過(guò)程，該通路異常激活可致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，在多種實(shí)體腫瘤中起關(guān)鍵作用[20]。許多文獻(xiàn)證實(shí)在卵巢癌細(xì)胞體外研究中均表達(dá)為STAT3的高磷酸化，卵巢癌JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移，抑制這一通路可能是治療卵巢癌的候選途徑[21]。

卵巢的預(yù)后與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程包括細(xì)胞的黏附、遷移、侵入以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解。金屬基質(zhì)蛋白酶由腫瘤細(xì)胞分泌，它可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，目前MMPs家族已分離出28個(gè)成員(MMP1 ～MMP28)。其中MMP2、MMP9是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，其高表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[22]。

吉馬酮是否具有抗卵巢癌細(xì)胞的作用尚不清楚。本研究首先通過(guò)CCK8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)吉馬酮能顯著抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖能力，抑制作用隨著時(shí)間、濃度的增加不斷增強(qiáng)，存在濃度和時(shí)間依賴性。再進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示吉馬酮處理后的癌細(xì)胞其劃痕愈合率顯著低于對(duì)照組。Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)表明吉馬酮處理后的卵巢癌細(xì)胞穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少，說(shuō)明吉馬酮可顯著抑制其遷移侵襲能力。已有研究發(fā)現(xiàn)吉馬酮可以通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖，可以通過(guò)降低MMP9的表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞的遷移侵襲。為探究吉馬酮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力是否也與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路、降低MMP2、MMP9蛋白表達(dá)相關(guān)，故進(jìn)行了Western blot實(shí)驗(yàn)，探究不同濃度吉馬酮作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞后相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示吉馬酮作用于SKOV3細(xì)胞后可抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)，下調(diào)p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3。說(shuō)明吉馬酮抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路活性有關(guān)，其對(duì)酪氨酸激酶的激活有特異性抑制作用，進(jìn)而減少了其下游的STAT3發(fā)生磷酸化，這條在卵巢癌中異常激活的信號(hào)通路被阻滯，從而抑制了癌細(xì)胞的異常增殖。Western blot法顯示不同濃度吉馬酮作用于SKOV3細(xì)胞后可不同程度地抑制MMP2、MMP9表達(dá)，說(shuō)明吉馬酮抑制SKOV3細(xì)胞侵襲遷移能力可能是通過(guò)抑制MMP2、MMP9蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了吉馬酮可明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的體外增殖、遷移、侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路、下調(diào)MMP2和MMP9蛋白表達(dá)有關(guān)?？蔀檠芯考R酮治療卵巢癌提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但吉馬酮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖遷移、侵襲是否有其他信號(hào)途徑參與，以及這些信號(hào)通路是否與JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)尚不清楚，其是否通過(guò)多靶點(diǎn)抑制卵巢癌尚需進(jìn)一步研究。