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      鵝源鼠傷寒沙門菌的分離與耐藥性分析

      2021-11-11 06:14:06鐘藝煊王麗揚(yáng)王彥紅劉學(xué)忠
      中國獸醫(yī)雜志 2021年6期
      關(guān)鍵詞:內(nèi)酰胺酶沙門革蘭

      鐘藝煊,周 佳,陳 革,王麗揚(yáng),王彥紅,劉學(xué)忠

      (1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 , 江蘇 揚(yáng)州 225009;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 , 江蘇 揚(yáng)州 225009)

      我國是畜禽養(yǎng)殖大國,而沙門菌病的發(fā)生與流行一直影響著畜牧業(yè)的健康發(fā)展,是現(xiàn)階段養(yǎng)殖場重要的細(xì)菌性傳染病之一[1]。鼠傷寒沙門菌屬于沙門菌B群,是一種重要的人獸共患病病原,其感染率與發(fā)病率較高[2]。沙門菌有廣泛的宿主范圍,各年齡的動物均可以感染,通常侵害幼年和青年動物。鵝感染鼠傷寒沙門菌時(shí),肝臟有明顯的腫大、壞死,顏色呈古銅色;消化道呈現(xiàn)不同程度的充血、水腫、出血及灶性壞死[3];同時(shí)伴有明顯的心包炎和氣囊炎。目前,臨床主要通過抗生素來防治鼠傷寒沙門菌感染。由于不同地區(qū)分離得到的沙門菌有比較大的差異,部分養(yǎng)殖場不合理的使用抗生素,病原在比較長的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行演化,進(jìn)而導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn),加大了對沙門菌病的防治難度,對公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重的影響。本試驗(yàn)通過收集臨床病料,進(jìn)行病原分離和鑒定,開展藥敏試驗(yàn)和相關(guān)耐藥基因的檢測,為鵝群鼠傷寒沙門菌病的防控提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 病料的來源 所用的病料分別是從安徽、泰州和鎮(zhèn)江送檢的疑似沙門菌感染的病鵝的病變組織。

      1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基,購自杭州微生物制劑有限公司;沙門菌屬診斷血清,購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司;腸桿菌科細(xì)菌生化管和藥敏紙片,包括慶大霉素(10 μg)、阿莫西林(20 μg)、丁胺卡那(30 μg)、卡那霉素(30 μg)、頭孢哌酮(75 μg)、頭孢曲松(30 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、復(fù)方新諾明(23.75/1.25 μg)、鏈霉素(10 μg)、多西環(huán)素(30 μg)、諾氟沙星(10 μg)、氟苯尼考(30 μg)、環(huán)丙沙星(5 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、多黏菌素B(300IU)、妥布霉素(10 μg)、美洛西林(75 μg)以及新霉素(30 μg)共18種 抗菌藥,均購自杭州微生物試劑有限公司。

      1.3 細(xì)菌分離 采集肝臟、心臟、關(guān)節(jié)液等病料,無菌接種于麥康凱培養(yǎng)基上,置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,挑選生長良好的菌落,在麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化培養(yǎng)。挑選純培養(yǎng)后的單個(gè)菌落,按照《獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[4]要求進(jìn)行革蘭染色,鏡檢,觀察細(xì)菌的形態(tài)以及顏色。

      1.4 生化試驗(yàn) 挑取純培養(yǎng)后的單個(gè)菌落,接種于腸桿菌科細(xì)菌生化管中,37 ℃ 恒溫培養(yǎng)12 h。

      1.5 沙門菌侵襲蛋白A(invA)基因的PCR鑒別試驗(yàn) 通過特異性的親膜蛋白invA基因的PCR擴(kuò)增試驗(yàn)來鑒定沙門菌。所用的引物:F:5′-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC-3′;R:5′-GCATTATC-GATCAGTACCAGCCGTCT-3′[5]。PCR擴(kuò)增體系為20 μL,模板為純化后的疑似沙門菌單菌落提取的DNA。擴(kuò)增程序:95 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性35 s,57 ℃退火 35 s,72 ℃ 延伸40 s,共32個(gè)循環(huán);72 ℃ 終延伸7 min。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

      1.6 血清學(xué)試驗(yàn) 采用玻板凝集試驗(yàn)來進(jìn)行血清學(xué)分型。首先取一環(huán)A~F多價(jià)血清于載玻片上,再挑取適量待檢細(xì)菌,與之混合均勻,30 s內(nèi)觀察凝集情況。若產(chǎn)生顆粒狀凝集則判斷為陽性(反之,則為陰性),陽性樣品再分別選用O∶4、O∶9、O∶12、O∶5、O∶7 等因子血清進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn),判定待檢細(xì)菌的群別。根據(jù)判斷的O抗原群別,進(jìn)行H抗原的第一相和第二相判定。

      1.7 藥敏試驗(yàn) 取適量純培養(yǎng)后的細(xì)菌,用十字劃線法均勻涂在普通瓊脂培養(yǎng)基上,將藥敏試紙片輕輕貼于培養(yǎng)基表面,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈直徑大小,根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)動物種特異的獸醫(yī)病原菌抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行判定。

      1.8 β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)耐藥基因測定 挑取適量菌落,煮沸法制備細(xì)菌基因組模板。采用PCR擴(kuò)增試驗(yàn)進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)耐藥基因的檢測,測定基因?yàn)門EM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2和CTX-M-9,測定時(shí)需要使用的具體引物序列見表1。

      表1 本試驗(yàn)所用PCR引物

      2 結(jié)果

      2.1 細(xì)菌分離 采集的病料(表2)分離后,在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好,形成圓形、無色、大小均勻的菌落。將純化后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色,鏡檢可見革蘭陰性中等大小的直桿菌,這些都與革蘭陰性菌的鏡檢結(jié)果一致。

      表2 細(xì)菌來源與血清型模式

      2.2 生化試驗(yàn) 結(jié)果顯示,10株分離株均不發(fā)酵乳糖,發(fā)酵麥芽糖,能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,不利用水楊甘、蔗糖,也不產(chǎn)生α甲基葡萄糖苷。不能分解尿素,不產(chǎn)生吲哚,V-P試驗(yàn)陰性,甲基紅試驗(yàn)陽性,在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生H2S,符合沙門菌的生化特性。

      2.3invA基因的PCR鑒別試驗(yàn) 以10株分離株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果均出現(xiàn)大小約為330 bp的目的條帶(圖1),與預(yù)期的片段大小相符,即分離株為沙門菌。

      圖1 特異性親膜蛋白invA基因的PCR鑒別

      2.4 血清學(xué)試驗(yàn) 10株分離株的抗原模式全部與鼠傷寒沙門菌的抗原模式一致,為1,4,[5],12:i,2,符合鼠傷寒沙門菌的抗原模式,均為鼠傷寒沙門菌(表2)。

      2.5 藥敏試驗(yàn) 10株鼠傷寒沙門菌分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示(表3),所分離的菌株對氟苯尼考的耐藥性為50%;對阿莫西林、美洛西林等藥物的耐藥性為30%;對環(huán)丙沙星、慶大霉素、頭孢曲松等藥物的耐藥性為20%;但對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥性為0。且分離得到的20181226E1-3、20181226E1-4、20181226E1-S2、20181226E1-S3和20181226E1-T這5株分離株同時(shí)對喹諾酮類、氨基糖苷類、氯霉素類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類五類抗生素耐藥,為多重耐藥性菌株。

      表3 分離株對不同抗菌藥物的耐藥情況

      2.6 β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)耐藥基因測定 對10株鼠傷寒沙門菌進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶類抗生素相關(guān)耐藥基因的檢測,結(jié)果顯示,20190111E1-1和20190111E1-2這2株鼠傷寒沙門菌分離株檢出CTX-M-9(圖2),并且這2株都為CTX-M-65。TEM、SHV、CTX-M-1和CTX-M-2均未檢出。

      圖2 CTX-M-9耐藥基因PCR擴(kuò)增

      3 討論

      本試驗(yàn)分離出的10株鼠傷寒沙門菌均來自鵝,有7株來自泰州,2株來自鎮(zhèn)江,1株來自安徽。沙門菌是一種嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的細(xì)菌性病原微生物[8],對雛鵝的危害非常大。

      藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,本次試驗(yàn)分離得到的10株菌株中已有5株為多重耐藥菌株,而這5株分離株來自同一個(gè)養(yǎng)殖場。近年來,隨著3代頭孢菌素以及廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物在臨床的廣泛使用,革蘭陰性桿菌中β-內(nèi)酰胺酶的檢出率也日益增高[9],CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶已經(jīng)取代SHV和TEM型β-內(nèi)酰胺酶,成為革蘭陰性桿菌中最常檢出的基因型[10]。由質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶可通過轉(zhuǎn)移接合作用(相同或不同種屬細(xì)菌間)導(dǎo)致耐藥基因的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[11],嚴(yán)重時(shí)會導(dǎo)致耐藥菌株在局部大規(guī)模暴發(fā)[12]。本試驗(yàn)在20190111E1-1和20190111E1-2分離株中檢測到耐藥基因CTX-M-9,2株分離株均來自同一養(yǎng)殖場,且耐藥表型為對頭孢噻肟和頭孢曲松均耐藥,其余8株分離株對頭孢噻肟和頭孢曲松均不耐藥,耐藥基因和耐藥表型的符合率為100%,這與余菊等[13]的沙門菌CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型及變異研究的結(jié)果相一致。

      目前,尚且沒有特別有效的疫苗來預(yù)防鼠傷寒沙門菌,因此在養(yǎng)殖過程中,需要加強(qiáng)對沙門菌病的防治工作,做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療,具體體現(xiàn)在病畜出現(xiàn)死亡時(shí)及時(shí)剖檢進(jìn)行細(xì)菌分離,并對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果制定科學(xué)合理的用藥方案。獸醫(yī)主管部門要與時(shí)俱進(jìn),制定有效的防控措施,并且嚴(yán)格貫徹執(zhí)行;平時(shí)加強(qiáng)對養(yǎng)殖戶的培訓(xùn);種畜禽場要做好凈化工作,建立無沙門菌感染的種群[14];加強(qiáng)對畜禽產(chǎn)品的檢疫工作,最終保障人類的健康。

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