寧俊帆，郭玉寶，宋 睿，朱世民，董 鵬

安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000

引 言

稻谷收獲后即開始陳化，胚乳發(fā)生一系列理化和生化變化，導(dǎo)致顏色、氣味、糊化特性及微觀結(jié)構(gòu)的改變[1]，使食用品質(zhì)劣變。在顏色上，陳米的胚乳表面整體光澤度下降，呈灰粉狀且有白色溝紋，部分米粒邊緣發(fā)黃甚至有咖啡色；在氣味上，陳米會出現(xiàn)霉味和酸味等異味；在質(zhì)構(gòu)方面，陳米組織硬化，韌性低，質(zhì)感脆，結(jié)構(gòu)松散，按壓易碎。陳米由于結(jié)構(gòu)變得緊密，糊化中水分難以滲入，造成糊化時間延長且米飯黏性下降[2]。即使顏色和氣味不變，糊化特性也會發(fā)生劣變。越來越多的研究表明，蛋白質(zhì)的變化與糊化特性變化密切相關(guān)，但是蛋白質(zhì)的氧化變化光譜表征較少。

研究表明，大米陳化后巰基氧化成二硫鍵，谷蛋白平均分子量增加[3]。陳化后清蛋白中α-螺旋減少，脂肪族氨基酸側(cè)鏈被包埋；球蛋白與淀粉相互作用加強，谷蛋白與淀粉的結(jié)合減弱；醇溶蛋白反平行-β折疊結(jié)構(gòu)增加，二硫鍵構(gòu)型改變，酪氨酸殘基更加暴露[4]。吳偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，米糠中游離脂肪酸氧化形成活性脂氧化物，導(dǎo)致谷蛋白氧化和功能性質(zhì)改變。現(xiàn)有文獻(xiàn)對大米陳化后谷蛋白結(jié)構(gòu)變化的研究多集中在電泳表征分子量[6]，巰基變化表征二硫鍵氧化[7]，熒光光譜表征芳香族氨基酸殘基微環(huán)境的變化[8]及紅外光譜和圓二色光譜表征二級結(jié)構(gòu)[9]，對谷蛋白巰基氧化產(chǎn)物的表征研究較少。分子量的表征主要是通過電泳法，蛋白質(zhì)常被加熱變性，因此不能確定蛋白質(zhì)的變性是在陳化期間發(fā)生，還是在電泳實驗變性處理時發(fā)生的。已有報道缺乏對谷蛋白單獨陳化產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化及其對功能性質(zhì)的影響研究，特別是對與空氣接觸的富含蛋白的米粒外層中谷蛋白的結(jié)構(gòu)變化研究未見報道。

米粒中蛋白分布不均，米粒外層蛋白含量高于胚乳內(nèi)部，且大米陳化中米粒外層暴露于空氣中，未見米粒外層中谷蛋白的拉曼和紅外光譜研究。本實驗選用富含蛋白的米粒外層米粉作為原料，采用Osborne法[10]順序提取獲得谷蛋白，表征谷蛋白在陳化前后的結(jié)構(gòu)變化和功能性質(zhì)變化[11]，為闡明蛋白質(zhì)在稻米陳化中的作用，控制陳化以減少糧食產(chǎn)后損失奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料和試劑

大米，購于蘇果超市，初始含水量14.08%±0.07%。

花生油，益海嘉里糧油股份有限公司；牛血清白蛋白(BR)、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)：分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；溴化鉀：光譜純，Merck KGaA Millipore Corporation。

1.2 儀器

稻谷精米檢測機(JGMJ8090)，上海嘉定糧油儀器有限公司；高速萬能粉碎機(FW-100)，天津泰斯特儀器有限公司；紅外光譜分析儀(FT-IR200)，美國Nicolet公司；激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(HR-800型)，法國Jobin-Yvon公司；紫外分光光度計(UV-5800C)，上海元析儀器有限公司；離心機(L-550)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大米儲藏陳化及谷蛋白提取和陳化

大米儲藏陳化：將新鮮大米分成兩份，分別裝入廣口瓶中密封，一份在4 ℃下貯存保鮮，作為對照；另一份放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中儲藏12個月，獲得陳米[12]。利用稻谷精米機對大米進(jìn)行剝蝕碾磨，收集米粒外層15%米粉，過40目篩，裝入自封口袋中在4 ℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

谷蛋白提取[10]：稱取40 g米粉，加160 mL正己烷在25 ℃脫脂1 h，抽濾，沉淀在室溫?fù)]發(fā)24 h，得脫脂米粉。取40 g脫脂米粉，先用蒸餾水和5% NaCl脫除清蛋白和球蛋白后，再用160 mL 0.1 mol·L-1的NaOH提取谷蛋白1 h，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液重復(fù)提取1次。合并兩次上清液靜置6 h，4 000 r·min-1離心10 min，上清液先用1.0 mol·L-1的HCl調(diào)pH至6.0，再用0.1 mol·L-1HCl調(diào)pH至4.8，等電沉淀谷蛋白。靜置沉淀6 h后，4 000 r·min-1離心10 min；沉淀用兩倍蒸餾水洗滌，離心。洗滌后的沉淀用0.1 mol·L-1的NaOH調(diào)pH至7.0，離心，沉淀用2倍蒸餾水洗滌兩次。所得沉淀凍干，得谷蛋白。分別以新米和陳米作為原料，通過上述方法獲得新米谷蛋白和陳米谷蛋白。

新米谷蛋白的陳化：將上述新米谷蛋白分成兩份，一份在37 ℃下儲藏12個月(模擬大米儲藏陳化條件)，獲得經(jīng)陳化的新米谷蛋白(陳化谷蛋白)；另一份在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 谷蛋白拉曼光譜分析

谷蛋白的拉曼光譜分析參照Guo[4]的方法，測定條件：激光波長514.5 nm，功率20 mW，到達(dá)樣品的光斑直徑約1 μm。測前，激光波長在520.7 nm處以單晶硅校正。掃描時間60 s，掃描波數(shù)范圍200～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1, 樣品掃描速度120 cm-1·min-1，每1 cm-1記錄數(shù)據(jù)。50×長焦鏡頭(LMP)，在背散射方向收集拉曼信號，至少3個不同的樣品點被測試并記錄。所獲得數(shù)據(jù)采用Omnic 8.0軟件進(jìn)行基線校正、平滑(nine-point Golay-Savitzky procedure)。因?qū)嶋H獲得的拉曼光譜強度不僅與物質(zhì)含量有關(guān)，還受到激光器強度、拉曼探頭與樣品相對距離、光纖傳輸效率、檢測器量子效率等其他因素的影響。即使利用高性能拉曼光譜儀，并嚴(yán)格控制測試條件，也不能保證同一樣品的拉曼強度在平行測定中不產(chǎn)生差異。因此以苯丙氨酸峰為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理進(jìn)行強度校正[4, 13]。

1.3.3 谷蛋白紅外光譜分析

紅外光譜分析采用溴化鉀壓片法[4]：將蛋白粉末與干燥的溴化鉀按1∶100混合后研磨至足夠細(xì)，在壓片機上以10 T·cm-2壓片，直至得到的壓片均勻無裂痕呈半透明狀。在紅外光譜儀上掃描，波數(shù)400～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1，掃描512次獲得疊加譜，試驗重復(fù)3次，譜圖用Omnic 8.0分析。

1.3.4 谷蛋白功能性質(zhì)的測定

(1)溶解性的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[14]：取4支試管，各稱取0.010 g谷蛋白樣品，分別加入pH值3，5，7和9的10 mmol·L-1PBS緩沖液1 mL，渦旋振蕩3次，每次3 s，得到不同pH值下的1%蛋白懸液。將蛋白懸液于5 000 r·min-1下離心10 min，取上清液用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)持水性和持油性的測定

參照文獻(xiàn)[15]，采用重量法測定：稱取0.100 g谷蛋白樣品于預(yù)先恒重的離心管m1中，加入5 mL蒸餾水(花生油)，渦旋振蕩3次，每次3 s，在40 ℃恒溫水浴中保溫30 min。將混合物在4 000 r·min-1下離心10 min，傾去上清液，稱取離心管質(zhì)量m2。通過公式：持水性(持油性)(mL·g-1)=(m2-m1-0.100)/0.100，計算樣品的持水性和持油性。

(3)乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

參照文獻(xiàn)[5]用濁度法：稱取0.015 g樣品，分散于15 mL pH 7.4的10 mmol·L-1的PBS緩沖液中，得到1 mg·mL-1谷蛋白懸液，加入5 mL花生油，用高速分散均質(zhì)機以10 000 r·min-1的速度均質(zhì)2 min。立刻取出20 μL谷蛋白-花生油乳狀液與5 mL 0.1% SDS溶液混合均勻，以0.1% SDS為空白，在500 nm處測定吸光度(記為A0)。剩下的谷蛋白-花生油乳狀液靜置30 min后，以同樣的方法測定吸光度(記為A30)。則：乳化性(m2·g-1)=(2×2.303A0N)/(c×φ×10 000)，乳化穩(wěn)定性(min)=A0/(A0-A30)×30，其中N為稀釋倍數(shù)取250(20 μL蛋白-花生油乳狀液與5 mL 0.1% SDS混勻)，c為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(1 mg·mL-1)，φ為油相所占的體積分?jǐn)?shù)(0.25)。

(4)起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定

參照文獻(xiàn)[5]：取5個50 mL燒杯，各稱取0.100 g谷蛋白；向燒杯中分別加入pH值為3，5，7，9和11的0.05 mol·L-1PBS緩沖液各10 mL，得到不同pH值下1%蛋白分散液，用高速分散均質(zhì)機以10 000 r·min-1的速度均質(zhì)30 s，連續(xù)4次共2 min，均質(zhì)后的泡沫體積記為V0；靜置30 min后再次記錄泡沫體積V30。則：起泡性=(V0-10)/10×100%，泡沫穩(wěn)定性=(V30-10)/(V0-10)×100%。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 8.01進(jìn)行單因素方差分析及鄧肯多重比較[16](Duncan’s Multiple Range Test)，p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 谷蛋白陳化變化的拉曼光譜分析

拉曼光譜適合研究同原子間形成的非極性鍵，能表現(xiàn)出氨基酸側(cè)鏈所處微環(huán)境的變化，從而為蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的變化提供信息。新米谷蛋白、陳米谷蛋白和陳化谷蛋白的拉曼光譜見圖1，拉曼頻率、官能團(tuán)指認(rèn)和歸一化強度見表1。

圖1 陳化后谷蛋白拉曼光譜變化

表1 谷蛋白拉曼光譜特征峰指認(rèn)

由表1可以看出，陳米谷蛋白和陳化谷蛋白在1 665/1 666 cm-1與1 218/1 219 cm-1處的拉曼光譜強度明顯低于新米谷蛋白，此兩峰分別歸屬于酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ帶，說明陳米谷蛋白和陳化谷蛋白中α-螺旋明顯減少[17]。在516，527，1 035，1 124，1 152，1 159，1 316和1 334 cm-1處，陳米谷蛋白和陳化谷蛋白的峰強度明顯高于新米谷蛋白，這歸屬于含硫氨基酸殘基的氧化產(chǎn)物——二硫鍵、亞砜和砜，表明陳化后谷蛋白中巰基發(fā)生氧化[17-18]。481，1 451和2 936 cm-1峰均歸屬C—H鍵，陳化前后谷蛋白峰的拉曼強度變化不明顯。857/830 cm-1為酪氨酸的Fermi共振，陳化后谷蛋白峰的強度比明顯增大，說明谷蛋白中酪氨酸殘基更加暴露[17, 19]。749/751/755 cm-1為色氨酸吲哚環(huán)的拉曼峰位，陳化后強度提高說明谷蛋白色氨酸殘基被埋藏[17-18]。O—H伸縮峰3 423 cm-1在陳化后顯著增強，說明分子間鍵合程度升高，谷蛋白與淀粉分子結(jié)合更緊密[19]。實驗結(jié)果，不管是陳米中的谷蛋白，還是新米谷蛋白被提取出來后再陳化，α-螺旋結(jié)構(gòu)均明顯減少，含硫氨基酸氧化，酪氨酸殘基更深度暴露，色氨酸殘基更深度埋藏，谷蛋白與淀粉分子之間結(jié)合更為緊密。這些拉曼光譜特征，有力地說明了陳化后谷蛋白含硫氨基酸氧化形成二硫鍵、亞砜和砜的存在，以及陳化谷蛋白比陳米谷蛋白氧化程度更高，為稻米陳化劣變中谷蛋白的氧化提供了光譜學(xué)依據(jù)。

2.2 谷蛋白陳化變化的紅外光譜分析

紅外光譜反映分子振動-轉(zhuǎn)動能級，與振動過程中分子偶極矩的變化相關(guān)，反映分子內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)，可進(jìn)一步說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。從圖2和表2可以看出，陳米谷蛋白在1 153，1 078和1 026 cm-1處的吸收峰明顯增強。1 153 cm-1為砜的特征吸收，1 078和1 027 cm-1為亞砜的特征吸收[20]。三處均表征含硫的氧化產(chǎn)物，說明陳化引起了含硫氨基酸殘基的氧化，包括巰基氧化成二硫鍵、亞砜和砜等。谷蛋白在931 cm-1附近出現(xiàn)了較弱的吸收，此為糖環(huán)骨架的特征吸收峰[20]，陳米谷蛋白的此吸收峰強度比新米谷蛋白大，表明陳化后谷蛋白存在糖基化趨勢，與淀粉分子的結(jié)合更加緊密，可能影響了陳米的糊化特性[21]。

圖2 陳化后谷蛋白紅外光譜變化

表2 谷蛋白紅外特征頻率及歸屬

2.3 陳化對谷蛋白功能性質(zhì)的影響

2.3.1 陳化對谷蛋白溶解性的影響

由圖3可知，不同pH值下，陳米谷蛋白的溶解性均明顯低于新米谷蛋白，且在pH 3時差異最大。陳化谷蛋白的溶解性僅在pH 3時低于陳米谷蛋白，而在其他pH值下高于陳米谷蛋白，且在pH 9時比新米谷蛋白更高。這些結(jié)果說明，陳化使得谷蛋白的溶解性降低，在酸性條件下尤為明顯，這可能與光譜分析中所示谷蛋白氧化有關(guān)。陳化使更多的疏水基團(tuán)暴露，降低了蛋白質(zhì)溶解性。

圖3 陳化對谷蛋白溶解性的影響

2.3.2 陳化對谷蛋白持水性和持油性的影響

由圖4(a)可知，新米谷蛋白的持水性最高，其次是陳米谷蛋白，陳化谷蛋白的持水性最低。而持油性變化趨勢與持水性正相反[圖4(b)]，新米谷蛋白的持油性最低，陳米谷蛋白其次，陳化谷蛋白的持油性最高。實驗結(jié)果表明谷蛋白的陳化降低了持水性，提高了持油性，這一變化支持光譜解析中谷蛋白陳化后疏水基暴露的結(jié)果。新米谷蛋白被提取出來后單獨陳化的變化更明顯，表明淀粉對谷蛋白陳化有一定緩解作用。

圖4 陳化對谷蛋白持水性(a)和持油性(b)的影響

2.3.3 陳化對谷蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性影響

由圖5(a)可見，新米谷蛋白、陳米谷蛋白和陳化谷蛋白乳化性依次顯著降低；新米谷蛋白的乳化穩(wěn)定性最高，陳米谷蛋白和陳化谷蛋白乳化穩(wěn)定性明顯降低，但二者間差異不明顯[圖5(b)]。乳化性降低與蛋白質(zhì)溶解性降低密切相關(guān)，陳化使蛋白質(zhì)氧化程度加深，疏水基更加暴露，溶解性下降。

圖5 陳化對谷蛋白乳化性(a)和乳化穩(wěn)定性(b)的影響

2.3.4 陳化對谷蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性影響

由圖6可見，在pH 3和pH 11時，新米谷蛋白、陳米谷蛋白和陳化谷蛋白起泡性依次顯著降低；在其他pH下也呈下降趨勢，但變化不顯著。起泡性是蛋白質(zhì)分散于界面成薄的能力，起泡性降低，說明其分散能力下降，顯示了陳化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)氧化引起的溶解性降低。由圖7可知，在各pH值下，泡沫穩(wěn)定性變化不明顯，說明谷蛋白的陳化變化對泡沫穩(wěn)定性影響不顯著。

圖6 陳化對谷蛋白起泡性的影響

圖7 陳化對谷蛋白泡沫穩(wěn)定性的影響

3 結(jié) 論

比較了新米谷蛋白、陳米谷蛋白和陳化谷蛋白的拉曼和紅外光譜及三種谷蛋白功能性質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)陳米谷蛋白和陳化谷蛋白比新米谷蛋白的α-螺旋減少，含硫氨基酸殘基氧化產(chǎn)物增多，酪氨酸殘基更加暴露，色氨酸殘基更加埋藏，分子間結(jié)合程度更高，說明陳化中谷蛋白發(fā)生了氧化，并體現(xiàn)在蛋白功能性質(zhì)變化上。陳米谷蛋白溶解性、持水性、乳化性和乳化穩(wěn)定性均比新米谷蛋白低，而持油性比新米谷蛋白高，支持谷蛋白在陳化中發(fā)生的氧化變化。陳化谷蛋白溶解性(除pH 9)、持水性和乳化性比陳米谷蛋白更低，持油性更高，說明提取出來的新米谷蛋白單獨陳化氧化程度更深?？梢?，通過拉曼和紅外光譜能很好地表征大米陳化過程中米粒外層中谷蛋白的氧化，與蛋白功能性質(zhì)的變化相一致，說明了稻米陳化劣變的內(nèi)在原因，這為控制稻米陳化劣變、減少產(chǎn)后損失提供了依據(jù)。