袁紅平 王立波 郜志鵬 俞曉鵬 解生彬*

(1.鹽城市麋鹿研究所，鹽城，224136；2.江蘇省大豐麋鹿國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，鹽城，224136)

血液生理、生化指標(biāo)能客觀反映動(dòng)物機(jī)體的生理性變化，通過對(duì)血液生理生化指標(biāo)的測定能認(rèn)識(shí)動(dòng)物的生命活動(dòng)規(guī)律，其變化與機(jī)體的生理或病變相關(guān)性極高。動(dòng)物血液生理生化指標(biāo)的研究對(duì)種群科學(xué)管理十分重要，而血液生理生化指標(biāo)監(jiān)測方法因具有操作簡便、損傷較小、判讀容易等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病臨床診斷和治療[1]。近年來對(duì)有蹄類(Artiodactyla)動(dòng)物的血液生理生化指標(biāo)研究開展很多，如林麝(Moschusberezovskii)、梅花鹿(Cervusnippon)、重慶地區(qū)圈養(yǎng)白唇鹿(Przewalskiumalbirostris)、牦牛(Bosgrunniens)、圈養(yǎng)毛冠鹿(Elaphoduscephalophus)、豚鹿(Axisporcinus)等[2-7]；除了有蹄類動(dòng)物外，圈養(yǎng)金錢豹(Pantherapardus)、會(huì)理黑山羊(Capraaegagrushircus)、圈養(yǎng)山魈(Mandrillussphinx)等也有相關(guān)研究[8-10]。這些血液生理生化的研究對(duì)動(dòng)物臨床疾病檢測、治療保護(hù)、飼養(yǎng)管理和營養(yǎng)生態(tài)學(xué)等研究都具有顯著指導(dǎo)意義。

麋鹿(Elaphurusdavidianus)是原產(chǎn)于中國的特有珍稀瀕危物種，屬于國家一級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物[11]。1865年，法國傳教士阿芒·大衛(wèi)第1次科學(xué)性的發(fā)現(xiàn)這一奇特的動(dòng)物，并命名為Père David’s deer。目前，我國已有麋鹿遷地保護(hù)場所50多處，總數(shù)8 000多頭，是重引入物種的一個(gè)典范。國內(nèi)外對(duì)麋鹿的研究成果豐碩：宏觀研究方面包括種群動(dòng)態(tài)、發(fā)情期晝間活動(dòng)時(shí)間分配、行為譜、瀕危機(jī)制、交配計(jì)策、生境與行為、棲息地退化、記憶、滅絕風(fēng)險(xiǎn)、潛在生境評(píng)價(jià)、種群結(jié)構(gòu)等[12-13]；微觀研究方面包括遺傳多樣性、組織解剖學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、疾病診治和生理生化等[14]。

麋鹿的血液生理生化相關(guān)研究國外起步較早，Beck等報(bào)道了美國多個(gè)人工飼養(yǎng)麋鹿的血液生理生化指標(biāo)[15]。國內(nèi)學(xué)者以北京南海子麋鹿苑個(gè)體為樣本測定麋鹿的生理代謝、免疫、肝功能等指標(biāo)，分析健康麋鹿自由基代謝水平，探索麋鹿的健康評(píng)價(jià)體系并建立生理生化指標(biāo)正常值參考范圍[16-21]。但由于地理位置、環(huán)境、食物來源、放養(yǎng)模式等差異，不同地域麋鹿的血液指標(biāo)可能具有一定差異性。盡管前人以大豐麋鹿個(gè)體為樣本開展過糞樣激素水平、血液生理生化、不同性別和季節(jié)血漿性激素水平的測定[22-24]，但由于麋鹿種群數(shù)量的持續(xù)增加、活動(dòng)范圍的擴(kuò)大、日糧結(jié)構(gòu)的變化等，進(jìn)一步開展大豐麋鹿種群血清生理、生化及性激素水平研究，對(duì)麋鹿的適應(yīng)能力、繁殖能力、疾病的診斷治療以及保護(hù)、管理模式具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為江蘇省大豐麋鹿保護(hù)區(qū)的健康麋鹿，共119頭，其中雄性麋鹿64頭(幼鹿7頭、亞成體17頭、成體40頭)，雌性麋鹿55頭(幼鹿6頭、亞成體11頭、成體38頭)。參照《簡明養(yǎng)鹿手冊》[25]，結(jié)合實(shí)際觀測，麋鹿年齡結(jié)構(gòu)的劃分標(biāo)準(zhǔn)為：斷奶至1歲為幼體，1.0—3.5歲為亞成體，3.5歲以上為成體。選取的幼鹿種群為2019年4月出生的個(gè)體，均為2月齡，模擬野外母鹿以牛乳和牧草相結(jié)合方式喂養(yǎng)。亞成體為2018年4月出生的個(gè)體，均為14月齡，以青貯飼料和配合飼料喂養(yǎng)。成體麋鹿選取第一、第二、第三放養(yǎng)區(qū)的麋鹿，以毛色、角型、牙齒和是否仔鹿跟隨來判定發(fā)育狀態(tài)。

1.2 方法

1.2.1 血液采集

春、秋和冬季在09：00，夏季在08：00，利用吹管法注射鹿眠靈(2.0 mL)對(duì)測試麋鹿進(jìn)行麻醉保定，待其完全進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，用添加抗凝素的專用真空采血管頸靜脈采集血液，每只采集3管，每管5 mL，其中1支為EDTA負(fù)壓采血管，2支為加有促凝劑的促凝管。EDTA負(fù)壓采血管血樣溫和顛倒混勻4—5次后，4℃保存待用；促凝管血樣室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心10 min待用。采血后每頭麋鹿肌肉注射鹿醒靈4 mL催醒。

1.2.2 儀器及檢測方法

鹿眠寧、鹿醒靈，由吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)。血樣采集后立即送往大豐和鹽城市婦幼保健院血液檢驗(yàn)中心。

血液生理指標(biāo)用優(yōu)利特2900VetPlus全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(COULTER ACT diff2TM)測定白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均血紅蛋白質(zhì)量(MCH)、平均血紅蛋白質(zhì)量濃度(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差(RDW-SD)、血小板總數(shù)(PLT)、血小板平均體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、血小板壓積(PCT)等指標(biāo)。

血液生化指標(biāo)采用優(yōu)利特8036全自動(dòng)生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TB)、直接膽紅素(DB)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、尿素(UREA)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHOL)、葡萄糖(GLU)、球蛋白(GLB)等生化指標(biāo)；采用優(yōu)利特910A電解質(zhì)分析儀(離子選擇性電極法)測定鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)、離子鈣(Ca2+)指標(biāo)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2007、SPSS 21.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。所有數(shù)據(jù)先做單一樣本K-S檢驗(yàn)(One-Sample Kolmogor-Smirnov test)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，對(duì)符合正態(tài)分布以Independent-Sample test檢驗(yàn)，否則以Mann-WhitneyU檢驗(yàn)各檢測指標(biāo)的差異，以單因素方差分析(one-way ANOVA)分析進(jìn)行不同年齡結(jié)構(gòu)和不同飼養(yǎng)模式指標(biāo)的兩兩比較，P<0.05差異顯著，P<0.0l差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 麋鹿血液生理指標(biāo)的性別差異

血液生理常規(guī)測定結(jié)果顯示：雄性麋鹿在紅細(xì)胞指標(biāo)、中性粒細(xì)胞指標(biāo)、血紅蛋白指標(biāo)和血小板總數(shù)上高于雌性，而雌性麋鹿淋巴細(xì)胞指標(biāo)和平均血紅蛋白質(zhì)量濃度高于雄性，經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)，其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)(表1)。

續(xù)表1

2.2 麋鹿血液生化指標(biāo)的性別差異

雌雄麋鹿生化指標(biāo)常規(guī)測定結(jié)果(表2)顯示：雄性堿性磷酸酶和葡萄糖指標(biāo)高于雌性，尿酸、尿素、膽固醇和甘油三酯指標(biāo)低于雌性，經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)，其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

2.3 麋鹿血液生理指標(biāo)的年齡差異

由表3可見，不同年齡結(jié)構(gòu)雌性麋鹿生理指標(biāo)的測定結(jié)果顯示：幼體與亞成體淋巴細(xì)胞比率、中間細(xì)胞總數(shù)、中間細(xì)胞比率、紅細(xì)胞壓積和紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)指標(biāo)差異顯著(P<0.05)，中性粒細(xì)胞比率、紅細(xì)胞總數(shù)、平均血紅蛋白質(zhì)量、平均血紅蛋白質(zhì)量濃度、血小板總數(shù)和血小板壓積指標(biāo)差異極顯著(P<0.01)；幼體與成體在白細(xì)胞總數(shù)、平均血紅蛋白質(zhì)量濃度、血小板總數(shù)、血小板壓積指標(biāo)上差異顯著(P<0.05)，淋巴細(xì)胞比率、淋巴細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞比率指標(biāo)差異極顯著(P<0.01)；亞成體與成體在中間細(xì)胞比率、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積指標(biāo)上差異顯著(P<0.05)，其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)(表3)。對(duì)雌性麋鹿的19項(xiàng)生理指標(biāo)檢測結(jié)果中，幼體雌性麋鹿白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等12項(xiàng)指標(biāo)顯著高于亞成體和成體，說明幼體麋鹿的器官發(fā)育還不完善，免疫力較差。

不同年齡結(jié)構(gòu)雄性麋鹿生理指標(biāo)的測定結(jié)果(表3)顯示：幼體與亞成體淋巴細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞平均體積、平均血紅蛋白質(zhì)量、血小板平均體積指標(biāo)差異顯著(P<0.05)，白細(xì)胞總數(shù)、中間細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞總數(shù)、血小板總數(shù)、血小板壓積指標(biāo)差異極顯著(P<0.01)；幼體與成體中間細(xì)胞比率、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差指標(biāo)差異顯著(P<0.05)，白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞比率、中性粒細(xì)胞比率、淋巴細(xì)胞總數(shù)、中間細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞平均體積、平均血紅蛋白質(zhì)量、血小板總數(shù)、血小板平均體積和血小板壓積指標(biāo)差異極顯著(P<0.01)；亞成體與成體中性粒細(xì)胞比率、紅細(xì)胞平均體積、平均血紅蛋白質(zhì)量差異顯著(P<0.05)，淋巴細(xì)胞比率、淋巴細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞壓積指標(biāo)差異極顯著(P<0.01)。對(duì)雄性麋鹿的19項(xiàng)生理指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，幼體雄性麋鹿白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板總數(shù)等14項(xiàng)指標(biāo)幼體顯著高于亞成體和成體，與不同年齡結(jié)構(gòu)雌性麋鹿血液生理指標(biāo)的檢測結(jié)果一致。

表3 不同年齡結(jié)構(gòu)麋鹿血液生理指標(biāo)差異(one-way ANOVA)Tab.3 Analysis of blood physiology index of Père David’s deer with different ages structure(one-way ANOVA)

2.4 麋鹿血液生化指標(biāo)的年齡差異

不同年齡結(jié)構(gòu)雌性麋鹿生化指標(biāo)的測定結(jié)果(表4)顯示：幼體-亞成體麋鹿的總蛋白、白蛋白、總膽紅素和鉀離子指標(biāo)差異極顯著(P<0.01)；亞成體-成體麋鹿的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶指標(biāo)差異顯著(P<0.05)，總蛋白、尿酸和離子鈣差異極顯著(P<0.01)；而幼體-成體麋鹿的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血清總蛋白、白蛋白、總膽紅素、直接膽紅素、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素、肌酐、尿酸、膽固醇、球蛋白、鉀離子、離子鈣多項(xiàng)指標(biāo)差異性極顯著(P<0.01)。對(duì)雌性麋鹿19項(xiàng)生化指標(biāo)的檢測結(jié)果顯示，幼體雌麋鹿蛋白、腎功能指標(biāo)顯著低于亞成體和成體；膽紅素、酶類顯著高于亞成體和成體，主要由于幼鹿肝腎等多功能還不夠完善。

根據(jù)對(duì)不同年齡結(jié)構(gòu)雄性麋鹿生化指標(biāo)的測定結(jié)果(表4)顯示：幼體-亞成體麋鹿的堿性磷酸酶、肌酐、膽固醇和氯離子差異顯著(P<0.05)，血清總蛋白、白蛋白差異極顯著(P<0.01)；亞成體-成體麋鹿的尿素、肌酐、葡萄糖和離子鈣差異性極顯著(P<0.01)；而幼體-成體麋鹿的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿酸、葡萄糖和氯離子差異顯著(P<0.05)，血清總蛋白、白蛋白、直接膽紅素、堿性磷酸酶、尿素、肌酐、膽固醇、球蛋白和離子鈣差異性極顯著(P<0.01)。對(duì)雄性麋鹿19項(xiàng)生化指標(biāo)的檢測結(jié)果顯示，幼體雄性麋鹿肝功能指標(biāo)高于亞成體和成體，腎功能指標(biāo)低于亞成體和成體，與不同年齡結(jié)構(gòu)雌性麋鹿生化指標(biāo)的研究結(jié)果一致。

表4 不同年齡結(jié)構(gòu)麋鹿血液生化指標(biāo)差異(one-way ANOVA)Tab.4 Analysis of blood biochemical indexes of Père David’s deer with different ages (one-way ANOVA)

3 討論

3.1 性別對(duì)麋鹿血液生理生化指標(biāo)的影響

由麋鹿個(gè)體間血液生理指標(biāo)分析結(jié)果可知，大部分?jǐn)?shù)值的變異系數(shù)較小，說明麋鹿血液生理指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定，變異系數(shù)較大的指標(biāo)主要是白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中間細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，推測是由于不同個(gè)體對(duì)外界環(huán)境刺激的應(yīng)答差異。血小板和紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)在雌雄麋鹿間有顯著差異，但表現(xiàn)出顯著的雄性高于雌性，與鐘震宇等[16]和孫大明等[22]的研究結(jié)果一致，初步推測雄雌指標(biāo)高低具有一定規(guī)律性。參照北京南海子麋鹿苑健康麋鹿血液生理生化指標(biāo)，白細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞數(shù)量和血小板數(shù)量指標(biāo)均偏低[21]，不在參考值范圍內(nèi)的9項(xiàng)指標(biāo)也與鐘震宇等[16]對(duì)南海子麋鹿苑麋鹿血液生理生化指標(biāo)范圍的測定結(jié)果基本相吻合，但是測定結(jié)果和對(duì)大豐麋鹿種群的報(bào)道[22]有差異，這可能是因?yàn)轺缏寡荷砩笜?biāo)值與麋鹿的飼養(yǎng)方式、營養(yǎng)狀況、遺傳變異、應(yīng)激情況等有一定關(guān)系。曾有報(bào)道大豐麋鹿種群貧血麋鹿的血液生理生化值，除嗜中性白細(xì)胞指標(biāo)值高于正常指標(biāo)值外，其他指標(biāo)遠(yuǎn)低于正常指標(biāo)值[26]。本研究表明，大豐麋鹿保護(hù)區(qū)的麋鹿通過人工補(bǔ)飼，營養(yǎng)狀況有了顯著改善，通過血紅蛋白的指標(biāo)值可以看出不存在貧血的現(xiàn)象，說明麋鹿健康狀況良好，能夠增加麋鹿的代謝水平和免疫能力，提高抵抗力。

由麋鹿血液生化指標(biāo)分析結(jié)果可知，19項(xiàng)檢測指標(biāo)中有10項(xiàng)表現(xiàn)出雄性高于雌性，有12項(xiàng)指標(biāo)雄雌高低差異與前人對(duì)南海子麋鹿苑麋鹿的研究[20]一致，有12項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)超過了20%，與鐘震宇等[16]研究結(jié)果吻合，說明這些指標(biāo)在血液中的含量很不穩(wěn)定。堿性磷酸酶主要來自骨骼，由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，堿性磷酸酶的活力是機(jī)體的骨代謝率與成骨作用的程度，研究結(jié)果顯示雄性顯著高于雌性，這可能與雄性第二性征鹿角的生長有關(guān)。血液中甘油三酯和膽固醇的指標(biāo)值是體內(nèi)脂肪利用情況的反應(yīng)，甘油三酯越低說明個(gè)體對(duì)脂肪的利用程度越高，而且膽固醇還是合成腎上腺皮質(zhì)激素和性激素的重要原料，研究結(jié)果顯示雄性顯著低于雌性，推測與雄麋鹿的活動(dòng)量和性行為有關(guān)。而雄性麋鹿的葡萄糖指標(biāo)顯著低于雌性，可能與麋鹿的采食、體型有關(guān)。本研究測定結(jié)果部分指標(biāo)與白唇鹿、毛冠鹿等鹿科(Cervidae)動(dòng)物吻合度較高[4，6]，這可能由于同屬于食草動(dòng)物。本研究結(jié)果中，尿酸指標(biāo)值與南海子麋鹿種群血液生化指標(biāo)的檢測相比差異顯著，與前人對(duì)大豐麋鹿種群的報(bào)道基本一致，說明大豐麋鹿種群生境中水、植被等含鹽量仍然較高[21-22]。本研究顯示，大豐麋鹿種群膽紅素指標(biāo)顯著高于前人研究，但其他肝膽功能指標(biāo)與前人研究基本吻合，說明麋鹿的肝膽功能未有顯著損傷，至于偏高原因有待進(jìn)一步探究。

3.2 年齡對(duì)麋鹿血液生理生化指標(biāo)的影響

對(duì)不同年齡結(jié)構(gòu)雌性和雄性麋鹿生理指標(biāo)的分析表明，幼體與亞成體、幼體與成體白細(xì)胞總數(shù)及分類指標(biāo)、血紅蛋白質(zhì)量和質(zhì)量濃度及血小板有關(guān)指標(biāo)存在顯著差異，而且幼體的指標(biāo)較高，可能跟幼體免疫力、抗病能力較低有關(guān)，需要增加與免疫有關(guān)的生理指標(biāo)來抵御外界環(huán)境的變化。不同年齡結(jié)構(gòu)雌雄麋鹿生化指標(biāo)分析表明，幼體與成體多數(shù)指標(biāo)存在顯著差異。血清中天門冬氨酸和谷丙氨酸在心臟和肝臟中的活性最高，常用于肝臟和心臟功能好壞的評(píng)價(jià)指標(biāo)。總膽紅素、直接膽紅素廣泛用于肝膽疾病及溶血性疾病的診斷，膽紅素測定一直作為一項(xiàng)重要的常規(guī)肝功能指標(biāo)廣泛用于臨床。肌酐是肌肉在動(dòng)物體內(nèi)代謝的產(chǎn)物[27]，尿素、尿酸取決于食物中氮含量與腎功能的狀態(tài)，反映的都是腎臟的功能狀態(tài)。Na+主要作用是維持血漿和組織間液等細(xì)胞外液的滲透壓，調(diào)節(jié)酸堿度；K+有維持細(xì)胞內(nèi)液的滲透壓，參與細(xì)胞內(nèi)糖、蛋白質(zhì)和能量代謝，維持心肌的功能；Cl-參與細(xì)胞外液滲透壓的調(diào)節(jié)、內(nèi)液酸堿平衡的調(diào)節(jié)；Ca2+參與骨骼的構(gòu)建[5]。幼體麋鹿天門冬氨酸、膽紅素指標(biāo)、肌酐、尿酸、尿素顯著高于成體，可能與幼體肝腎功能還不完善有關(guān)。而幼體麋鹿Ca離子顯著低于成體，可能與幼體骨骼生長所需Ca總量較多有關(guān)?？偟鞍赘叩涂梢苑从吵龈?、腎和機(jī)體代謝功能是否正常，在機(jī)體內(nèi)的含量不同階段經(jīng)常變化，球蛋白也是重要的免疫指標(biāo)，能反應(yīng)機(jī)體的抗病能力[9]。總蛋白是白蛋白和球蛋白的總稱，也由肝臟合成，具有維持血漿正常膠體滲透壓和pH值、運(yùn)輸脂肪酸和膽紅素等作用的一類小分子蛋白質(zhì)[28-29]。幼體總蛋白、白蛋白和球蛋白指標(biāo)顯著低于成體，說明幼體麋鹿的臟器發(fā)育不完善，抵抗力較差。堿性磷酸酶是一種磷酸單脂酶，在肝臟、骨骼、腸和腎等重要組織器官均有分布，其在血液中的含量與骨骼發(fā)育存在關(guān)聯(lián)[12]。幼體血液中堿性磷酸酶顯著高于成體，幼體堿性磷酸酶主要來源于骨骼，隨著麋鹿長大成熟、骨骼成年化，骨骼中堿性磷酸酶會(huì)逐漸減少。所以，以堿性磷酸酶指標(biāo)值作為麋鹿疾病診斷的參考時(shí)，一定要結(jié)合麋鹿年齡以及其他指標(biāo)值。血清中Na、K、Ca等離子具有共同維持神經(jīng)肌肉和某些組織器官正常興奮性的作用，尤其Ca離子還是判斷骨細(xì)胞活性的重要指標(biāo)。而電解質(zhì)的指標(biāo)值能直接評(píng)價(jià)麋鹿日糧的適合程度和麋鹿的代謝水平，結(jié)果表明年齡結(jié)構(gòu)對(duì)麋鹿電解質(zhì)的影響主要體現(xiàn)在Ca離子，而Na+、K+在各年齡段麋鹿體內(nèi)都處于平衡狀態(tài)。