俞士勇， 彭 歡， 王化愷， 駱 洋， 項(xiàng)洪剛*

1.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院普通外科，上海 201299 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院胃腸外科，上海 200127

結(jié)直腸癌發(fā)病率及致死率在全球居高不下[1]。早期結(jié)直腸癌患者多無特殊癥狀，或僅有腹痛、排便習(xí)慣改變等非特異性表現(xiàn)。多數(shù)患者確診時(shí)已為進(jìn)展期或晚期，而進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者術(shù)后由于易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對(duì)較差[2]。因此，探索結(jié)直腸癌患者的早期診斷和預(yù)后判斷十分重要。臨床上主要通過影像學(xué)檢查、消化內(nèi)鏡及病理檢查診斷結(jié)直腸腫瘤，而分子標(biāo)志物應(yīng)用相對(duì)較少。借助分子基因技術(shù)，在微觀層面上研究結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展越來越被重視。

Rab蛋白是小GTP蛋白酶，其相對(duì)分子量為20 000～30 000，存在于大多真核細(xì)胞內(nèi)與膜相關(guān)細(xì)胞器中[3]。Rab27是Rab蛋白主要的成員之一，包含2種亞型，分別為Rab27A和Rab27B[4]。研究[5]表明，Rab27A在機(jī)體中主要作用是幫助運(yùn)輸小泡聚集和靠近靶膜，進(jìn)而導(dǎo)致外泌體釋放。細(xì)胞內(nèi)的Rab27A異常表達(dá)可促進(jìn)癌癥的發(fā)生及增加遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)。例如Rab27A可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生[6]，其過度表達(dá)與胃癌和卵巢癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)[7]。目前認(rèn)為，Rab27A的表達(dá)異常在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。然而，國(guó)內(nèi)有關(guān)Rab27A在結(jié)直腸癌中作用的報(bào)道尚不多見。

本研究通過比較Rab27A mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌組織和正常組織間表達(dá)水平的差異，同時(shí)分析Rab27A表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理資料的相關(guān)性及Rab27A與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，探討其在結(jié)直腸癌診治中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2005年1月至2019年1月在上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院普通外科和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院胃腸外科接受手術(shù)治療的125例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本及臨床病理資料。患者在手術(shù)前未接受新輔助化療或其他針對(duì)腫瘤的治療，均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。本研究經(jīng)浦東新區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)和仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(prylz 2020-008)，所有患者均知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qPCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程公司。Rab27A抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，GAPDH和山羊多克隆抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR) 使用TRIzol試劑盒從組織中提取RNA，根據(jù)GeneAmp PCR System 9600的說明書，逆轉(zhuǎn)錄總RNA成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃，15 min；85℃，5 s。Rab27A引物：正義鏈5’-GAA GCC ATA GCA CTC GCA GAG-3’，反義鏈5’-ATG ACC ATT TGA TCG CAC CA-3’；內(nèi)參GAPDH引物：正義鏈5’-ACT CGT CAT ACT CCT GCT-3’，反義鏈5’-GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3’。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法。以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，取均值。

1.4 Western印跡法 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織樣品中加入適量的裂解液，低溫離心10 min后獲取目標(biāo)蛋白。將目標(biāo)蛋白與蛋白上樣緩沖液混合，100℃金屬浴5 min，冷卻后即可上樣。上樣結(jié)束后電泳90 min，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗(Rab27A, Abcam公司, 1∶1 000)。4℃過夜，第2天孵育二抗60 min。PVDF膜上均勻滴加適量發(fā)光液，ECL底物發(fā)光。

1.5 免疫組化 組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，水化，梯度乙醇脫水后，用0.3%過氧化氫孵育15 min，微波修復(fù)15 min，自然冷卻后10%牛血清白蛋白封閉30 min，滴加PBS稀釋過的Rab27A抗體(1∶200)，4℃過夜，HRP標(biāo)記的二抗孵育30 min，在顯微鏡下進(jìn)行DAB顯色。最后蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。Rab27A染色陽性表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于細(xì)胞質(zhì)中。光鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野，記錄1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞百分比，結(jié)合著色強(qiáng)度，按照表1的方式進(jìn)行半定量評(píng)分：每個(gè)腫瘤細(xì)胞最后得分為兩項(xiàng)乘積，小于4分為Rab27A低表達(dá)，大于或等于4分為Rab27A高表達(dá)。

表1 免疫組化染色計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用t檢驗(yàn)比較結(jié)直腸癌組織mRNA水平；采用χ2檢驗(yàn)比較Rab27A表達(dá)水平與臨床病理數(shù)據(jù)相關(guān)性；采用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗(yàn)比較Rab27A與結(jié)直腸癌生存率的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中Rab27A mRNA和蛋白表達(dá)水平差異 選取32對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(圖1A)顯示，結(jié)直腸癌腫瘤組織中Rab27A mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織(P=0.001)。隨機(jī)選取其中8對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(圖1B)表明，結(jié)直腸癌腫瘤組織中Rab27A蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。上述結(jié)果表明，Rab27A mRNA水平和蛋白水平在結(jié)直腸癌細(xì)胞中均為高表達(dá)。

圖1 Rab27A mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組和癌旁組織織中的表達(dá)情況

2.2 結(jié)直腸癌組織中Rab27A表達(dá)水平與臨床特點(diǎn)的關(guān)系 結(jié)果(圖2)顯示：Rab27A蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中也少許表達(dá)；Rab27A在腫瘤組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。根據(jù)表1對(duì)Rab27A的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)評(píng)分結(jié)果分為Rab27A高表達(dá)組(n=76)和Rab27A低表達(dá)組(n=49)。結(jié)果(表2)顯示，腫瘤大小和臨床分期在兩組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037，P=0.017)，而患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及CEA水平在兩組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 采用免疫組化檢測(cè)Rab27A在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

表2 Rab27A高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的臨床病理特點(diǎn)比較 n(%)

續(xù)表

2.3 Rab27A與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 結(jié)果(圖3)表明：Rab27A表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后可能存在相關(guān)性，即Rab27A表達(dá)水平越高，患者生存期越短。單因素分析結(jié)果(表3)表明，Rab27A表達(dá)水平、腫瘤大小及臨床分期與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有相關(guān)性。多因素分析結(jié)果(表3)表明，Rab27A或可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物。

圖3 Rab27A表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存率關(guān)系

表3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后單因素和多因素分析 n=125

3 討 論

以Rab家族為代表的經(jīng)典小GTP蛋白在機(jī)體正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要角色。Rab家族通過在GDP結(jié)合的非激活狀態(tài)與GTP結(jié)合的激活狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，參與調(diào)控正常的生物學(xué)功能[8]。有研究[9-10]顯示，Rab家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著至關(guān)重要的作用，例如Rab25可通過激活A(yù)kt/GSK-3β信號(hào)通路介導(dǎo)上皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲能力[9]；Rab25在卵巢癌患者腫瘤組織中表達(dá)量越高，患者術(shù)后預(yù)后越差；Rab25也可作為卵巢癌術(shù)后患者的預(yù)后預(yù)測(cè)分子[10]。Rab5與胞膜上的整合素相互作用促進(jìn)膜內(nèi)骨架蛋白形成細(xì)胞偽足，同時(shí)腫瘤細(xì)胞提高金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)9、MMP2等分子的分泌，加快細(xì)胞外基質(zhì)的溶解，加快腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散[11]。乳腺癌細(xì)胞中Rab8和Rab7有助于膜型金屬蛋白酶1(MT1-MMP)的分泌，而Rab7的顯性失活損害乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[12]。

研究[13]表明，Rab27A在囊泡運(yùn)輸過程中，特別是細(xì)胞外泌體的形成和分泌中發(fā)揮重要作用。外泌體在腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移中作用顯著[14]，且是理想的腫瘤抗原標(biāo)志。因此干擾Rab27A的表達(dá)可影響外泌體的分泌和生物功能，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Wang等[15]指出，Rab27A在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平異常升高，且表達(dá)量越高，患者預(yù)后越差，提示其可作為胰腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)分子。另有研究[16]指出，Rab27A通過促進(jìn)胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF-2)的分泌，可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，使乳腺癌患者預(yù)后更差。Chang等[17]指出，miRNA-134-3能通過降低Rab27A的表達(dá)來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生。Rab27A還與血管生成相關(guān)，抑制其表達(dá)會(huì)降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(VEGF-1)的棕櫚?；瑥亩鴾p弱VEGF-1穩(wěn)定性，使血管新生增加[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中Rab27A mRNA和蛋白較癌旁正常組織表達(dá)明顯增高。免疫組織化學(xué)法結(jié)果也提示結(jié)直腸癌組織中存在Rab27A高表達(dá)現(xiàn)象。Rab27A蛋白與結(jié)直腸癌臨床分期及腫瘤大小正相關(guān)，提示Rab27A可能參與腫瘤的分化及生長(zhǎng)過程。單因素分析表明，Rab27A表達(dá)水平升高與結(jié)直腸癌總體生存期相關(guān)；多因素分析表明，Rab27A的表達(dá)水平升高是結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素，提示在結(jié)直腸癌診斷治療中，Rab27A可作為一種新的潛在預(yù)后標(biāo)志物。

本研究存在一定局限性：病例數(shù)所限，且常規(guī)將腫瘤臨床分期分2組進(jìn)行初步比較，而Ⅳ期腫瘤與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期腫瘤的在生物學(xué)行為、診斷、治療及預(yù)后等多有不同，未來將對(duì)此進(jìn)行改進(jìn)。

綜上所述，本研究表明，Rab27A與結(jié)腸直腸癌發(fā)生發(fā)展有較強(qiáng)相關(guān)性，可作為潛在預(yù)后預(yù)測(cè)分子進(jìn)行深入研究，或可成為結(jié)直腸癌診治的一個(gè)新靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。