韓福新，馬善波，張 蕊

(1.西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院，陜西 西安710004；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安710032)

腦膠質(zhì)瘤是目前臨床中常見的腫瘤之一，由于其具有發(fā)病率高及治愈率低等多種特點(diǎn)[1-2]，所以治療藥物的研發(fā)仍是目前的臨床工作重點(diǎn)。替莫唑胺是目前臨床中應(yīng)用廣泛療效確切的治療腦膠質(zhì)瘤藥物，但在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出有效率低及復(fù)發(fā)率高等缺點(diǎn)[3]，所以替莫唑胺與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用可能是提高其對(duì)腦膠質(zhì)瘤治療效果的有效手段。白花丹素是從紫雪花、白花丹等植物中提取得到的單體化合物，近年來(lái)研究[4-5]發(fā)現(xiàn)其對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。然而白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制目前尚不清楚。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，MEK/ERK通路與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，MEK/ERK通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力增加。本實(shí)驗(yàn)通過研究白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)人源腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖抑制作用及對(duì)MEK/ERK通路的調(diào)節(jié)作用，為白花丹素在腦膠質(zhì)瘤治療中的藥理作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人源腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。白花丹素(貨號(hào)IP0650，純度>98%)；替莫唑胺(貨號(hào)IT1330，純度>98%)；RPMI-1640培養(yǎng)液(貨號(hào)10491)；青霉素-鏈霉素混合液(貨號(hào)P1400)；胎牛血清(貨號(hào)S9020)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C1086)；MEK(貨號(hào)AF1057)、ERK(貨號(hào)AF1051)、GAPDH(貨號(hào)AF1186)兔單克隆抗體；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào)A0208)；RNA提取試劑盒(貨號(hào)G3013)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)G3330)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒(貨號(hào)P0012)；CCK-8試劑盒(貨號(hào)C0039)；RIPA裂解液(貨號(hào)P0013B)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)P0018M)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(貨號(hào)C0221A)；TBST(貨號(hào)ST671)；PCR引物設(shè)計(jì)及合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。IX83熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；Gel Doc EZ凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Spectra Max iD5酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)；T100梯度PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；BB150-2TCS CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：U87細(xì)胞復(fù)蘇后使用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)及鏈霉素(100 mg/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待U87細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至約80%融合后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)各組U87細(xì)胞增殖抑制率：在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上分別設(shè)置空白對(duì)照組、替莫唑胺組、白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。收集U87細(xì)胞，使用PBS洗滌3次，使用不含胎牛血清及青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度，按照4×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度，將U87細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后去除培養(yǎng)液，替莫唑胺組加入含有濃度為100 μmol/L[8]替莫唑胺的新鮮培養(yǎng)液，白花丹素組加入含有濃度為10 μmol/L[9]白花丹素的新鮮培養(yǎng)液，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組加入含有白花丹素(10 μmol/L)及替莫唑胺(100 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液，空白對(duì)照組只更換新鮮培養(yǎng)液，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h后，將96孔板置于酶標(biāo)儀上，在450 nm處測(cè)定各組細(xì)胞OD值，分別計(jì)算24、48、72 h各組U87細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/ OD空白對(duì)照組)×100%。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組U87細(xì)胞遷移率：6孔板上分別設(shè)置空白對(duì)照組、替莫唑胺組、白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組。調(diào)整U87細(xì)胞密度，按照為1×105個(gè)/孔將U87細(xì)胞接種于6孔板中，加入不含胎牛血清及青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，白花丹素組加入終濃度為10 μmol/L的白花丹素，替莫唑胺組加入終濃度為100 μmol/L的替莫唑胺，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組加入白花丹素(10 μmol/L)及替莫唑胺(100 μmol/L)，空白對(duì)照組更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用200 μl移液槍尖頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕，在顯微鏡下測(cè)量?jī)蓷l劃痕間距離，記為0 h遷移距離，使用PBS洗滌兩次，去除漂浮細(xì)胞后，加入不含胎牛血清及青霉素-鏈霉素的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下測(cè)量24 h劃痕距離，記為24 h遷移距離，計(jì)算各組U87細(xì)胞遷移率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。細(xì)胞遷移率=(0 h遷移距離-24 h遷移距離)/ 0 h遷移距離×100%。

1.2.4 Transwell檢測(cè)各組U87細(xì)胞侵襲能力：收集U87細(xì)胞，設(shè)置空白對(duì)照組、替莫唑胺組、白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組，取約1×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔Transwell小室的上室，白花丹素組加入終濃度為10 μmol/L的白花丹素，替莫唑胺組加入終濃度為100 μmol/L的替莫唑胺，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組加入白花丹素(10 μmol/L)及替莫唑胺(100 μmol/L)，在24孔Transwell小室的下室補(bǔ)充含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液刺激細(xì)胞侵襲，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用棉簽去除上室的非侵襲細(xì)胞，下室的侵襲細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色，每組細(xì)胞隨機(jī)選擇4個(gè)視野，在顯微鏡下進(jìn)行拍照并對(duì)各組遷移細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 TUNEL法檢測(cè)各組U87細(xì)胞凋亡率：收集U87細(xì)胞，調(diào)整U87細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔將其接種于6孔板中，設(shè)置空白對(duì)照組、替莫唑胺組、白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組，白花丹素組加入終濃度為10 μmol/L的白花丹素，替莫唑胺組加入終濃度為100 μmol/L的替莫唑胺，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組加入白花丹素(10 μmol/L)及替莫唑胺(100 μmol/L)培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)液，使用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛室溫避光固定30 min，用PBS輕輕洗滌2次后，加入封閉液，室溫孵育30 min，用PBS洗滌2次，滴加透化液，冰上4 ℃孵育2 min，PBS洗2次，每孔加入50 μl TUNEL反應(yīng)混合物，在室溫條件下避光孵育1 h，PBS洗滌后加入抗熒光淬滅封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)算各組U87細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 RTq-PCR檢測(cè)U87細(xì)胞MEK及ERK mRNA表達(dá)水平：U87細(xì)胞分別用濃度為10 μmol/L的白花丹素， 100 μmol/L的替莫唑胺，白花丹素(10 μmol/L)聯(lián)合替莫唑胺(100 μmol/L)培養(yǎng)48 h后，使用TRIzol試劑從U87細(xì)胞中提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用RTq-PCR試劑盒測(cè)定各組U87細(xì)胞MEK、ERK、GAPDH mRNA水平，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.2.7 Western blot檢測(cè)U87細(xì)胞MEK及ERK蛋白表達(dá)水平：U87細(xì)胞分別用濃度為10 μmol/L的白花丹素， 100 μmol/L的替莫唑胺，白花丹素(10 μmol/L)聯(lián)合替莫唑胺(100 μmol/L)培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)液，使用PBS洗滌2次，使用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清液，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白含量，取相當(dāng)于40 μg蛋白的蛋白提取液，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣本，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，使用含有5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h后，使用MEK、ERK及GAPDH兔單克隆抗體(1∶500稀釋)在4 ℃條件下孵育過夜，使用含吐溫的PBS洗滌3次，5 min/次，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1000稀釋)室溫孵育2 h，再次用含吐溫PBS洗滌3次，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒在凝膠成像儀中成像，使用ImageJ 1.8.0軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)U87細(xì)胞的增殖抑制作用 見表2。與替莫唑胺組比較，白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞24、48、72 h增殖抑制率均顯著升高(均P<0.05)；與白花丹素組比較，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞24、48、72 h增殖抑制率均增殖抑制率顯著升高(均P<0.05)。

表2 白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)U87細(xì)胞的增殖抑制率比較(%)

2.2 白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)U87細(xì)胞遷移的影響 見圖1。與空白對(duì)照組比較，替莫唑胺組、白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞遷移率均顯著降低(均P<0.05)；與替莫唑胺組比較，白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞遷移率均顯著降低(均P<0.05)；與白花丹素組比較，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.05)。

2.3 白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)U87細(xì)胞侵襲能力的影響 見圖2。與空白對(duì)照組比較，替莫唑胺組、白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(均P<0.05)；與替莫唑胺組比較，白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(均P<0.05)；與白花丹素組比較，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。

2.4 白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響 見圖3。與空白對(duì)照組比較，替莫唑胺組、白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞凋亡率均顯著升高(均P<0.05)；與替莫唑胺組比較，白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞凋亡率均顯著升高(均P<0.05)；與白花丹素組比較，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與替莫唑胺組

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與替莫唑胺組

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與替莫唑胺組

2.5 白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)U87細(xì)胞MEK及ERK mRNA表達(dá)水平的影響 見表3。與空白對(duì)照組比較，替莫唑胺組、白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞MEK及ERK mRNA表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)；與替莫唑胺組比較，白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞MEK及ERK mRNA表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)；與白花丹素組比較，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞MEK及ERK mRNA表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。

表3 各組U87細(xì)胞MEK及ERK mRNA表達(dá)水平比較

2.6 白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)U87細(xì)胞MEK及ERK蛋白表達(dá)水平的影響 見圖4。與空白對(duì)照組比較，替莫唑胺組、白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞MEK及ERK蛋白表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)；與替莫唑胺組比較，白花丹素組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞MEK及ERK蛋白表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)；與白花丹素組比較，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞MEK及ERK蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與替莫唑胺組

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是臨床常見的原發(fā)性顱腦腫瘤，是由于大腦和脊髓膠質(zhì)細(xì)胞由于病毒感染、化學(xué)及電離輻射等多種原因引起的癌變，具有發(fā)病率及病死率高、治愈率低等特點(diǎn)。近年來(lái)流行病學(xué)研究[10]表明，腦膠質(zhì)瘤患者的中位生存期為14.6個(gè)月左右，其發(fā)病率為5/10萬(wàn)以上，在全部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者中，腦膠質(zhì)瘤患者約占27%，在惡性腫瘤中，其所占比例高達(dá)80%[11]。然而，臨床中對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的治療手段有限，主要采用手術(shù)治療及放化療的手段，但治療效果并不理想。同時(shí)，目前臨床中用于腦膠質(zhì)瘤的化療藥物有限，替莫唑胺是目前已在臨床中應(yīng)用的療效確切的治療腦膠質(zhì)瘤的藥物，但在臨床應(yīng)用中也表現(xiàn)出有效率低、不良反應(yīng)大等多種缺點(diǎn)，所以，對(duì)于治療腦膠質(zhì)瘤藥物的研發(fā)仍是當(dāng)前的工作重點(diǎn)之一。

白花丹素是從白花丹科植物，白花丹的根中提取得到的單體化合物。研究[12-14]表明，白花丹素對(duì)于卵巢癌、肝臟脂肪代謝異常、腎損傷等多種疾病具有顯著的治療作用。近年來(lái)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，白花丹素對(duì)于腦膠質(zhì)瘤具有一定的治療作用，其中，柴昌等[15]報(bào)道了白花丹素能夠顯著降低腦膠質(zhì)瘤SWO-38和U251細(xì)胞的增殖和遷移，并能夠促進(jìn)SWO-38和U251細(xì)胞的凋亡；Niu等[16]研究發(fā)現(xiàn)白花丹素能夠顯著抑制腦膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞的增殖和遷移；此外，Chen等[17]發(fā)現(xiàn)白花丹素能夠通過調(diào)節(jié)FOXM1及其下游蛋白，進(jìn)而抑制U87、A172、SHG44、U251細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，由此可見白花丹素對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的治療具有較大的潛力，然而其具體作用機(jī)制，及其對(duì)于替莫唑胺是否具有增敏作用目前尚不清楚。

本文通過研究白花丹素聯(lián)合替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白花丹素組、替莫唑胺組及白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，而U87細(xì)胞凋亡率則顯著升高，且與白花丹素及替莫唑胺單獨(dú)給藥組比較，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)降低更明顯，而U87細(xì)胞凋亡率則升高更顯著，提示白花丹素能夠顯著增加U87細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性，且白花丹素聯(lián)合替莫唑胺能夠顯著抑制U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡。

MEK/ERK通路主要參與細(xì)胞的增殖及凋亡等生理過程，近年來(lái)研究表明其在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移等活動(dòng)中起關(guān)鍵作用。孫關(guān)等[18]研究miR-15b對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株A172細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)MEK/ERK通路在A172細(xì)胞的增殖和凋亡過程中起關(guān)鍵作用，miR-15b則能夠通過抑制MEK/ERK通路相關(guān)蛋白，導(dǎo)致A172細(xì)胞G0/G1期阻滯，進(jìn)而導(dǎo)致A172細(xì)胞凋亡。王帆等[19]研究發(fā)現(xiàn)遷移誘導(dǎo)基因7能夠抑制腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的MEK及ERK蛋白水平，進(jìn)而抑制U251細(xì)胞的侵襲能力。趙永順等[20]報(bào)道MEK/ERK信號(hào)通路的激活與腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡有關(guān)，而抑制MEK/ERK信號(hào)通路的激活及相關(guān)蛋白水平，則能夠顯著誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡。由此可見MEK/ERK通路在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，而抑制MEK/ERK通路的過度激活則可能是治療腦膠質(zhì)瘤的潛在靶點(diǎn)和途徑。本研究結(jié)果表明，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺能夠顯著抑制U87細(xì)胞MEK、ERK蛋白水平的升高，且與替莫唑胺單獨(dú)給藥組比較，白花丹素聯(lián)合替莫唑胺組U87細(xì)胞MEK、ERK蛋白水平降低更明顯，提示白花丹素可能是通過抑制U87細(xì)胞MEK/ERK通路的過度激活，抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增加U87細(xì)胞對(duì)于替莫唑胺的敏感性。

綜上所述，白花丹素能夠增強(qiáng)U87細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性，顯著抑制U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MEK/ERK通路有關(guān)。