兩種冷沉淀凝血因子制備方法的比較

趙艷梅 李丹慧 祝凱捷

冷沉淀凝血因子是采用特定的方法將保存期限內(nèi)的新鮮冰凍血漿在1～6℃的密閉條件下融化后,分離出大部分血漿,并將剩余的冷不溶解物質(zhì)在1 h 內(nèi)速凍呈固態(tài)的成分血［1］。冷沉淀的功能是用來補(bǔ)充Ⅷ因子、因子、血管性血友病因子(vWF)、Fgb 和纖維結(jié)合蛋白,主要適用于Fgb 缺乏引起的出血,也可用于無特異性濃縮制劑使用時(shí)的Ⅷ因子缺乏癥、因子缺乏癥、血管性血友病、纖維蛋白異常及Fgb 缺乏癥；也可用于大量輸血、DIC 以及其他治療方法無效的尿毒癥出血［2］。隨著臨床輸血技術(shù)的不斷發(fā)展,冷沉淀制品已經(jīng)在臨床多個(gè)學(xué)科中應(yīng)用,其臨床價(jià)值愈顯重要,其臨床使用量呈現(xiàn)明顯增多趨勢［3-6］。手工制備冷沉淀凝血因子在融化、分離、稱重、熱合、工作效率的個(gè)體差異等諸多環(huán)節(jié)存在無法控制的人為因素,易造成冷沉淀凝血因子制備過程冷鏈不穩(wěn)定和時(shí)間鏈過長,從而導(dǎo)致冷沉淀凝血因子質(zhì)量不符合標(biāo)準(zhǔn)［7］。2017 年本站引進(jìn)了ZBK-LCD-A1 型冷沉淀凝血因子制備儀,采用全自動(dòng)水浴融化虹吸法制備冷沉淀凝血因子,與2～6 ℃儲(chǔ)血冷藏箱過夜融化離心法進(jìn)行分析比較,現(xiàn)將情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料 選取本血站于2017 年6 月～2020 年4 月,用400 ml 去白細(xì)胞采血袋采集的符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》的400 ml 全血244 袋,按照新鮮冰凍血漿制備操作規(guī)程制備而成。將新鮮冰凍血漿隨機(jī)分為冷藏箱過夜融化離心法組與全自動(dòng)水浴融化虹吸法組,各122 袋。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器 F Ⅷ因子(批號(hào)/效期：N0972303/201910),活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)液體試劑(批號(hào)/效期：N0972597/201909),CaCl2(批號(hào)/效期：N0972432/201909),凝血酶試劑(批號(hào)/效期：N1072925/201910)；質(zhì)控品(批號(hào)/效期：N0972598/202009),以上試劑由Instrumentation Laboratory Company 提供,均在有效期內(nèi)使用。2～6℃儲(chǔ)血冷藏箱(青島海爾,HXC-936)、冷沉淀凝血因子制備儀(山東中?？滇t(yī)療器具有限公司,ZBK-LCD-A1 型),全自動(dòng)血凝分析儀(Instrumentation Laboratory Company,ACL ELITE PRO,美國)。

1.2.2冷藏箱過夜融化離心法制備冷沉淀 將新鮮冰凍血漿置2～6℃儲(chǔ)血冷藏箱過夜融化。當(dāng)血漿基本融化時(shí),在離心力為4303 g、4℃的條件下離心10 min。將大部分上層冷上清移至空袋,將留下的30～40 ml 血漿與沉淀物混合,制成冷沉淀凝血因子。

1.2.3全自動(dòng)水浴融化虹吸法制備冷沉淀 使用前設(shè)置制備儀水浴溫度5℃和開機(jī)時(shí)間。將新鮮冰凍血漿袋置于冷沉淀凝血因子制備儀的水浴裝置中,另一空袋懸于水浴裝置外,位置低于血漿袋,兩袋之間形成的高度落差約20 cm。血漿融化后隨時(shí)被虹吸至空袋中,當(dāng)融化至剩下40～50 ml 血漿與沉淀物時(shí)儀器自動(dòng)閉合導(dǎo)管,阻斷虹吸。將血漿與沉淀物混合,制成冷沉淀凝血因子。

1.2.4檢測 用全自動(dòng)血凝分析儀檢測凝血因子Ⅷ活性(F Ⅷ ∶C) 和Fgb 濃度,分別乘以其容量得Ⅷ因子含量和Fgb 含量。

1.3觀察指標(biāo) 觀察比較兩組冷沉淀凝血因子的F Ⅷ、Fgb 含量及合格率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

全自動(dòng)水浴融化虹吸法組F Ⅷ含量高于冷藏箱過夜融化離心法組,Fgb 含量低于冷藏箱過夜融化離心法組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組F Ⅷ、Fgb 合格率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組冷沉淀凝血因子的F Ⅷ、Fgb 含量及合格率比較［,n(%)］

表1 兩組冷沉淀凝血因子的F Ⅷ、Fgb 含量及合格率比較［,n(%)］

注：與冷藏箱過夜融化離心法比較,aP<0.05

3 討論

目前臨床已廣泛應(yīng)用成分輸血,其中冷沉淀凝血因子為常用成分血。冷沉淀內(nèi)含凝血成分較多,可有效治療甲型血友病、血管性血友病及先天性或獲得性Fgb 缺乏癥等,還可有效預(yù)防血友病手術(shù)出血情況。因此,冷沉淀制備自采集至臨床輸注均需最大程度減少活性凝血成分,以免破壞Fgb、凝血因子F Ⅷ。其中,Fgb 較為穩(wěn)定,為凝血過程中具備蛋白水解活性的一連串凝血因子相繼激活的最終底物,即凝血酶形成作用于Fgb 使其轉(zhuǎn)為纖維蛋白,其含量升高可改變血小板聚集情況,還可經(jīng)多種方式結(jié)合生物組織,起到止血、填充作用。凝血因子F Ⅷ即抗血友病球蛋白,為冷沉淀內(nèi)最主要凝血因子,主要功能為參與因子Ⅸa 對因子X 的激活,進(jìn)而促使凝血酶原轉(zhuǎn)為凝血酶,使纖維蛋白經(jīng)交聯(lián)成為穩(wěn)固血栓而起到止血作用,其較不穩(wěn)定,半衰期約為8～12 h,較易失活,即含量可隨制備時(shí)間延長而不斷降低,有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,制備時(shí)間在12 h 其含量可減少約40%,制備時(shí)間在24 h 其含量可減少約42%,因此在制備時(shí)更需要注意制備方法的選擇,以提高凝血因子F Ⅷ含量與合格率。

本文結(jié)果顯示,全自動(dòng)水浴融化虹吸法制備冷沉淀凝血因子的Ⅷ因子含量高于冷藏箱過夜融化離心法,其含量提高了32.5%,而Fgb 含量卻降低了17.0%。分析其原因,冷沉淀從開始制備到速凍成固態(tài),采用冷藏箱過夜融化離心法制備冷沉淀大約要18～19 h,全自動(dòng)水浴融化虹吸法制備時(shí)間大約為1.5 h,兩種方法的制備時(shí)間相差約17 h。Ⅷ因子為不穩(wěn)定的凝血因子,其活性極易衰減,有文獻(xiàn)報(bào)道,體外4℃條件下保存,24 h 衰減情況從33.3%～58.1%［8,9］。Fgb 為穩(wěn)定的凝血因子,在1～6℃以不溶物狀態(tài)存在時(shí)其含量受制備時(shí)間的影響小,而受分離方法的影響大。王飛等［7］研究顯示在相同的水浴融化條件下,離心法制備的Fgb 含量比虹吸法提高了20.0%。

全自動(dòng)水浴融化虹吸法的特點(diǎn)為［10］：①可預(yù)約開機(jī)時(shí)間,自動(dòng)注水、排水,制備時(shí)間短；②每個(gè)袋子均有稱重盒智能稱重,制備效率高,冷鏈穩(wěn)定,冷沉淀凝血因子容量變異系數(shù)??；③制備過程信息化,可追溯。冷藏箱過夜融化離心法的特點(diǎn)為：①可批量制備,但制備的冷沉淀凝血因子的質(zhì)量受冷鏈、時(shí)間鏈、分離、稱重、工作效率、工作人員業(yè)務(wù)素質(zhì)等因素影響而不穩(wěn)定；②冷沉淀凝血因子容量變異系數(shù)大；③制備過程只有離心部分信息化。此外,在行冷沉淀凝血因子制備時(shí)還需要注意以下幾點(diǎn),即：確保靜脈穿刺順利,整個(gè)采血過程快且無誤,以便血液及抗凝劑盡早充分混合,從而確保冷沉淀內(nèi)F Ⅷ呈高度活性狀態(tài)。同時(shí),在完成血液采集后,應(yīng)立即存儲(chǔ)至冰箱,并經(jīng)專用血液運(yùn)輸箱運(yùn)輸血液,行制備時(shí)須以低溫工作臺(tái)進(jìn)行操作,確保血液采集后存儲(chǔ)、運(yùn)輸及制備均處于2～8℃下,以防凝血因子降解而影響成分血質(zhì)量。此外,應(yīng)于4～6 h內(nèi)完成新鮮冰凍血漿制備,且宜越短越好,以提高F Ⅷ因子回收率。行冷沉淀凝血因子制備時(shí)應(yīng)確保新鮮冰凍血漿澄清、無異常顏色、無蛋白、乳糜析出等。本站從2018 年1 月開始使用冷沉淀凝血因子制備儀至今,儀器運(yùn)行性能和穩(wěn)定性方面表現(xiàn)為偶爾出現(xiàn)血漿融化后虹吸速度過快或不虹吸。

綜上所述,全自動(dòng)冷沉淀凝血因子制備儀制備冷沉淀具有便捷、高效、冷鏈穩(wěn)定、時(shí)間鏈短、可信息化等特點(diǎn),但是制備儀的性能、穩(wěn)定性有待提高。冷沉淀凝血因子的質(zhì)量受影響因素較多,除了配備更專業(yè)的設(shè)備外,還需要有完善的流程,工作人員需具備較強(qiáng)的業(yè)務(wù)素質(zhì),嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程,才能制備出高質(zhì)量的冷沉淀凝血因子。