劉 蘭,張東雪,朱榮芳,梁向楠,李 暉,張勝雷(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科,石家莊 050011;通訊作者,E-mail:lei06352511@126.com)

血管鈣化是引起心腦血管疾病發(fā)生甚至死亡的重要危險因素[1]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡是引發(fā)血管鈣化的眾多機制中重要的機制之一[2]。高磷血癥是引起血管鈣化的始動因素,高磷可使VSMCs鈣化[3,4]。賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET8可甲基化非組蛋白TWIST、p53等,參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖等[5,6]。干擾SET8基因表達(dá)可促進(jìn)VSMCs發(fā)生鈣化[7]。但SET8在VSMCs鈣化中的研究較少,通過何種機制起作用尚不明確。鑒于此,本研究以大鼠VSMCs為模型,探討SET8在大鼠VSMCs鈣化中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

β-甘油磷酸購自美國Sigma公司;DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清均購自美國Gibco公司;RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司;實時熒光定量PCR試劑購自廣州易錦生物技術(shù)有限公司;SET8質(zhì)粒選自廣州復(fù)能基因有限公司;茜素紅S染料購自北京索萊寶有限公司;鈣含量測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司;SET8、AKT及Caspase-3抗體選自英國Abcam公司;p-AKT購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 實驗?zāi)Ｐ偷闹苽渑c分組

取4周齡清潔級、體質(zhì)量約80-100 g的雄性SD大鼠(選自河北醫(yī)科大學(xué),編號:1305090)。體外分離大鼠胸主動脈,采用組織貼壁法,將組織塊貼于瓶底,進(jìn)行原代培養(yǎng),傳代至第3-4代,為驗證高磷在血管平滑肌細(xì)胞鈣化中的作用,將血管平滑肌細(xì)胞分為兩組:①正常組:DMEM完全培養(yǎng)基;②高磷組(HP):完全培養(yǎng)基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸。

為進(jìn)一步驗證SET8的調(diào)控作用,將血管平滑肌細(xì)胞分為6組:①正常組:完全培養(yǎng)基;②空質(zhì)粒組:完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染SET8-shRNA的對照質(zhì)粒,濃度為2 μg/L;③SET8低表達(dá)組:完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染SET8-shRNA質(zhì)粒,濃度為2 μg/L;④高磷組:完全培養(yǎng)基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸,細(xì)胞未轉(zhuǎn)染;⑤空質(zhì)粒+高磷組:完全培養(yǎng)基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸,轉(zhuǎn)染SET8過表達(dá)的對照質(zhì)粒;⑥SET8過表達(dá)+高磷組:完全培養(yǎng)基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸,轉(zhuǎn)染SET8過表達(dá)質(zhì)粒,濃度為2 μg/L。然后檢測細(xì)胞鈣化和凋亡情況。

為進(jìn)一步驗證AKT對鈣化的影響,將細(xì)胞分為3組:①正常組:完全培養(yǎng)基;②對照組:完全培養(yǎng)基中加入1 μl DMSO;③AKT抑制劑組:完全培養(yǎng)基中加入1 μl DMSO溶解的AKT通路抑制劑LY294002。然后檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3 茜素紅染色檢測各組血管平滑肌細(xì)胞鈣化情況

干預(yù)后的血管平滑肌細(xì)胞,室溫條件下,用4%多聚甲醛固定25 min,用茜素紅(質(zhì)量濃度為0.1%,pH8.4)染色,于37 ℃環(huán)境孵育30 min,觀察橘紅色鈣結(jié)節(jié)情況,留取照片。

1.4 甲基麝香草酚藍(lán)比色法檢測各組血管平滑肌細(xì)胞鈣離子含量

細(xì)胞刺激后棄上清液,加入1 mol/L的稀鹽酸,進(jìn)行脫鈣過夜,取上清液,并測定鈣含量,VSMCs用0.1 mol/L的氫氧化鈉和0.1%的SDS孵育30 min,測定蛋白質(zhì)含量,用蛋白校正(mg/g)。

1.5 MTT法檢測各組血管平滑肌細(xì)胞增殖情況

取3代VSMCs以(3-10)×103個/ml接種于96孔板,生長至60%-70%融合時轉(zhuǎn)染2 μg/L的SET8質(zhì)粒。每組設(shè)3個復(fù)孔。實驗結(jié)束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl,培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)液,各孔加入二甲基亞砜150 μl,室溫振蕩10 min。于酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸光度(A)值,記錄結(jié)果。

1.6 血管平滑肌細(xì)胞凋亡檢測

取3代VSMCs接種于24孔板,生長至60%-70%融合時轉(zhuǎn)染2 μg/L的SET8質(zhì)粒和SET8-shRNA質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染72 h后,4%多聚甲醛固定25 min,PBS液洗2遍,參照TUNEL染色試劑盒進(jìn)行染色,加入50 μl反應(yīng)工作液,避光孵育1 h,滴加DAPI染色液封片,顯微鏡下觀察,藍(lán)色熒光代表所有的細(xì)胞核,綠色熒光代表凋亡細(xì)胞核。

1.7 實時熒光定量PCR檢測各組血管平滑肌細(xì)胞的SET8、AKT、Caspase-3 mRNA的表達(dá)

提取刺激后VSMCs的mRNA,測定SET8、AKT、Caspase-3 mRNA的表達(dá)?；蛞镄蛄幸姳?,以GAPDH為內(nèi)參。SET8、AKT、Caspase-3及GAPDH的反應(yīng)條件為:即95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s,40個循環(huán)。收集圖像并分析。

表1 各目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.8 Western blot檢測各組血管平滑肌細(xì)胞的SET8、AKT、Caspase-3蛋白的表達(dá)

提取刺激后的VSMCs蛋白,測定SET8、AKT、Caspase-3的表達(dá)。取50 μg蛋白質(zhì)加入10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中,恒壓95 V電泳1.5 h,恒壓95 V轉(zhuǎn)膜1 h,牛奶封閉1 h,放入一抗(p-AKT 1 ∶2 000,AKT 1 ∶1 000,SET8 1 ∶500,Caspase-3 1 ∶2 000,GAPDH 1 ∶5 000)稀釋液,4 ℃孵育過夜。次日洗膜,將膜置于二抗(1 ∶5 000),室溫下孵育1 h,于蛋白成像儀上顯色。以Image-ProPlus分析光密度,以GAPDH為內(nèi)參,結(jié)果以目的蛋白的相對表達(dá)量表示。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內(nèi)參積分光密度值(IOD)。實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高磷在VSMCs鈣化中的作用

2.1.1 給予高磷刺激后VSMCs鈣化情況 茜素紅染色顯示,與正常組比較,高磷組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)顯著增多,鈣離子含量顯著升高(P<0.05,見圖1)。

圖1 茜素紅染色觀察高磷對VSMCs鈣化的影響Figure 1 Effect of high phosphorus on calcification of VSMCs by Alizarin red staining

2.1.2 給予高磷刺激后VSMCs的AKT與Caspase-3的表達(dá)情況 與正常組比較,高磷組SET8和p-AKT蛋白相對表達(dá)量降低,Caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

與正常組比較,*P<0.05圖2 Western blot檢測各組VSMCs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 2 The expression of apoptosis-related proteins in VSMCs detected by Western blot

2.2 SET8在VSMCs鈣化中的作用

2.2.1 干擾SET8表達(dá)和給予SET8過表達(dá)后VSMCs鈣化情況 茜素紅染色顯示,與正常組和空質(zhì)粒組比較,SET8低表達(dá)組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)顯著增多,鈣離子含量顯著升高(P<0.05);與高磷組和空質(zhì)粒+高磷組比較,SET8過表達(dá)+高磷組橘紅色鈣化結(jié)節(jié)顯著減少,鈣離子含量顯著降低(P<0.05,見圖3)。

與正常組比較,*P<0.05；與空質(zhì)粒組比較,#P<0.05;與高磷組比較,&P<0.05；與空質(zhì)粒+高磷組比較,△P<0.05圖3 干擾SET8和過表達(dá)SET8對各組VSMCs鈣化的影響Figure 3 Effects of interference with SET8 and SET8 overexpression on calcification of VSMCs in each group

2.2.2 SET8對VSMCs增殖的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示,與正常組和空質(zhì)粒組比較,SET8低表達(dá)組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05);與高磷組和空質(zhì)粒+高磷組比較,SET8過表達(dá)+高磷組細(xì)胞增殖能力顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與正常組比較,*P<0.05;與空質(zhì)粒組比較,#P<0.05;與高磷組比較,&P<0.05;與空質(zhì)粒+高磷組比較,△P<0.05圖4 MTT檢測SET8對VSMCs增殖能力的影響Figure 4 Effect of SET8 on the proliferation of VSMCs by MTT assay

2.2.3 SET8對VSMCs凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示,與正常組和空質(zhì)粒組比較,SET8低表達(dá)組中綠色熒光顯著增多,提示SET8低表達(dá)組細(xì)胞凋亡增多;與高磷組和空質(zhì)粒+高磷組比較,SET8過表達(dá)+高磷組中綠色熒光顯著減少(見圖5),提示SET8過表達(dá)+高磷組細(xì)胞凋亡減少。

綠色為TUNEL染色陽性,藍(lán)色為DAPI染色細(xì)胞核圖5 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 (×200)Figure 5 Apoptosis detected by TUNEL staining (×200)

2.2.4 干擾SET8表達(dá)和給予SET8過表達(dá)后VSMCs中的AKT和Caspase-3的表達(dá) 與正常組和空質(zhì)粒組比較,SET8低表達(dá)組AKT及SET8的表達(dá)顯著降低(P<0.05),Caspase-3表達(dá)顯著升高(P<0.05);與高磷組和空質(zhì)粒+高磷組相比,SET8過表達(dá)+高磷組AKT及SET8的表達(dá)顯著升高(P<0.05),Caspase-3表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖6,7)。

與正常組比較,*P<0.05;與空質(zhì)粒組比較,#P<0.05;與高磷組比較,&P<0.05;與空質(zhì)粒+高磷組比較,△P<0.05圖6 實時熒光定量PCR檢測各組VSMCs凋亡相關(guān)基因表達(dá)Figure 6 Expression of apoptosis-related genes in VSMCs in each group by real time fluorescence quantitative PCR

與正常組比較,*P<0.05;與空質(zhì)粒組比較,#P<0.05;與高磷組比較,&P<0.05;與空質(zhì)粒+高磷組比較,△P<0.05圖7 Western blot檢測各組VSMCs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 7 The expression of apoptosis-related proteins in VSMCs was detected by Western blot

2.3 AKT在VSMCs鈣化中的作用

與正常組和對照組相比,AKT抑制劑組Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高,p-AKT的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖8)。

與正常組比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05圖8 實時熒光定量PCR和Western blot檢測凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)Figure 8 The expression of apoptosis-related genes and proteins detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot

3 討論

血管鈣化是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率增高的重要原因[8]。導(dǎo)致血管鈣化的重要危險因素之一是高磷血癥[9]。研究表明高磷可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生鈣化[4]。其中VSMCs發(fā)生鈣化的重要機制有VSMCs的凋亡[10]。本研究采用大鼠VSMCs為模型,發(fā)現(xiàn)干擾SET8表達(dá)可以加重VSMCs鈣化,可能是通過抑制AKT表達(dá),促進(jìn)Caspase-3表達(dá),從而促使VSMCs發(fā)生凋亡,進(jìn)而加重了VSMCs的鈣化。

SET8是一種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,能夠特異性地催化組蛋白H4賴氨酸20位(H4K20)單甲基化,主要調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖等生物學(xué)功能[7,11]。研究表明干擾SET8基因表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[7,12]。研究顯示高磷環(huán)境VSMCs會發(fā)生轉(zhuǎn)分化,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[8,13]。本項研究建立高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化模型,發(fā)現(xiàn)給予高磷刺激后,VSMCs發(fā)生鈣化,且SET8和AKT表達(dá)降低,Caspase-3表達(dá)升高,與研究結(jié)果一致[7,13]。Yang等[14]研究顯示SET8和TWIST能夠相互作用,SET8可催化H4K20單甲基化進(jìn)而可以調(diào)控TWIST靶基因的轉(zhuǎn)錄,而TWIST能夠增強AKT表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖[15,16]。本研究為了驗證SET8在VSMCs鈣化中的作用,干擾SET8表達(dá),發(fā)現(xiàn)鈣化程度加重,且AKT表達(dá)降低,Caspase-3表達(dá)升高。而在高磷環(huán)境增高SET8表達(dá),發(fā)現(xiàn)VSMCs鈣化顯著降低,且AKT表達(dá)升高,Caspase-3表達(dá)降低。MTT檢測細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示干擾SET8表達(dá)后細(xì)胞增殖能力降低,而在高磷環(huán)境增高SET8表達(dá)后細(xì)胞增殖數(shù)增加。TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,VSMCs給予高磷刺激后凋亡增多;干擾SET8表達(dá)后VSMCs凋亡增多,而在高磷環(huán)境增高SET8表達(dá)后VSMCs凋亡減少。表明高磷可能通過抑制SET8表達(dá),而抑制AKT表達(dá)、促進(jìn)Caspase-3表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)VSMCs凋亡,增加VSMCs鈣化的發(fā)生。

有研究表明活化的AKT可以使Caspase-3失活,從而抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡,進(jìn)而抑制了細(xì)胞發(fā)生鈣化[17,18]。本研究為驗證AKT是否通過抑制Caspase-3,而減輕VSMCs鈣化,給予AKT通路抑制劑,觀察Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示給予AKT通路抑制劑后,AKT表達(dá)降低,且凋亡基因Caspase-3的表達(dá)升高。表明活化的AKT可抑制Caspase-3的表達(dá),與研究結(jié)果一致。

綜上所述,高磷可促進(jìn)大鼠VSMCs鈣化,可能通過SET8-shRNA,抑制AKT表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)Caspase-3表達(dá),使VSMCs的凋亡增加,從而誘導(dǎo)了VSMCs的鈣化。