液液萃取-全碳同位素標記-液質(zhì)聯(lián)用法測定醬油中玉米赤霉烯酮

陽曦，劉瑋，向世杰

(1.綿陽市食品藥品檢驗所，四川 綿陽 621000；2.四川省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，成都 610000)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌產(chǎn)生的一類真菌毒素，在谷類和豆類及其制品中廣泛存在[1]。人或動物食用被玉米赤霉烯酮污染的食物后，會對健康造成一定危害，主要表現(xiàn)為生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)毒性[2-4]。世界衛(wèi)生組織規(guī)定玉米赤霉烯酮的最大耐受量為0.5 μg/(kg·d)，我國GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[5]中規(guī)定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量值為60 μg/kg。醬油的主要原料為大豆、小麥，均為受玉米赤霉烯酮污染的高風險作物。醬油在生產(chǎn)工藝上雖然有滅菌環(huán)節(jié)，但多采用高溫巴氏消毒法(85～90 ℃)進行，而玉米赤霉烯酮具有較強的耐熱性，在110 ℃以下加熱1 h以上才能完全被破壞。個別生產(chǎn)經(jīng)營者對釀造用糧存僥幸心理，在原料上沒有嚴格把關(guān)，導致醬油產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮超標。因此，非常有必要對醬油中的玉米赤霉烯酮進行檢測和控制。

文獻報道的玉米赤霉烯酮的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[6]、薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8-9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[11-12]。酶聯(lián)免疫法雖然靈敏度高，能夠達到1.0 μg/kg，但特異性差，陽性樣品需要進一步確證。薄層色譜法靈敏度較低，一般為0.1 mg/kg以上，同樣不能準確地定性。高效液相色譜法雖然具有較高的靈敏度(通常能達到1.0 μg/kg)，但樣品需要進行柱后衍生，分析時間長。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同樣需要衍生化處理，且方法的穩(wěn)定性差，應用并不廣泛。目前采用最多的是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法選擇性強、靈敏度高、定量準確，是近年來測定真菌毒素的首選方法。免疫親和柱凈化為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用最常見的凈化方法，但該方法存在成本較高、耗時長等缺點。本文采用液液萃取法對目標物進行提取凈化，前處理步驟簡單，經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，內(nèi)標法定量，實現(xiàn)了醬油中玉米赤霉烯酮的快速準確測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米赤霉烯酮標準溶液：100.0 μg/mL(乙腈)，青島Pribolab公司；13C18-Zearalenone標準溶液：25.0 μg/mL(乙腈)，青島Pribolab公司；乙腈(色譜純)：美國Thermo Fisher Scientific公司；甲醇、無水乙醇：分析純，成都市科隆化學品有限公司；三氯甲烷(分析純)：重慶川東化工有限公司。

樣品：市售醬油共18批。

U3000-4000 Q TRAP高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；ME204T/02電子天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Zearalenone標準使用溶液的配制

精密吸取Zearalenone標準溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1.00 μg/mL的標準使用溶液。

1.2.213C18-Zearalenone內(nèi)標使用溶液的配制

精密吸取13C18-Zearalenone標準溶液1 mL置于5 mL容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為5.00 μg/mL的內(nèi)標使用溶液。

1.2.3 樣品前處理

樣品經(jīng)充分混勻后，稱取試樣5 g于50 mL離心管中，加入13C18-Zearalenone內(nèi)標使用溶液40 μL，渦旋混合后靜置30 min。精密加入20 mL乙腈，渦旋5 min后以6000 r/min離心5 min，吸取上清液5 mL于氮吹管中，加入1 mL水、5 mL三氯甲烷，渦旋30 s后靜置分層，棄去上層溶液，下層溶液于50 ℃水浴中用氮氣吹干，加入1 mL 50%乙腈復溶，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后，待測定。

1.2.4 空白基質(zhì)溶液的制備

稱取空白基質(zhì)樣品5 g于50 mL離心管中加入13C18-Zearalenone內(nèi)標使用溶液40 μL，然后按1.2.3操作。

1.2.5 基質(zhì)標準系列工作液

取Zearalenone標準使用溶液適量，用空白基質(zhì)溶液制成濃度為5.0，25.0，50.0，75.0，100.0 ng/mL的基質(zhì)標準系列工作溶液，每個濃度溶液中內(nèi)標物13C18-Zearalenone的濃度為50 ng/mL。

1.2.6 液相色譜條件

色譜柱：Thermo Acclaim C18(3.0 mm×100 mm，3 μm)；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL；柱溫：35 ℃；流動相A：乙腈，流動相B：水；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 The gradient elution conditions of liquidchromatography

1.2.7 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源(electrospray ionization, ESI)負離子模式；多反應監(jiān)測(MRM)；離子化電壓：4500 V；離子源溫度：500 ℃；噴霧器壓力：55 psi；輔助加熱器壓力：50 psi；氣簾氣壓力：25 psi；其他參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Mass spectrometric analysis parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI-模式下，通過外置針泵連續(xù)進樣，將濃度為1 μg/mL的ZEN和13C18-ZEN混合標準溶液泵入質(zhì)譜儀。根據(jù)化合物的相對分子質(zhì)量及分子結(jié)構(gòu)特征，首先確定母離子的質(zhì)荷比(m/z)，再調(diào)整碰撞能量，分別選擇兩個響應值大的碎片離子為子離子，以豐度最大的子離子為定量離子，豐度次之的子離子為定性離子，再分別優(yōu)化碰撞能量和去簇電壓，得到MRM方法參數(shù)。

2.2 流動相的優(yōu)化

本試驗比較了乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-水、甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液作流動相的色譜行為。在動態(tài)調(diào)整流動相比例的梯度洗脫程序中，使目標化合物在各流動相體系中獲得最佳保留。結(jié)果表明，目標化合物在乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液體系中響應強度約為乙腈-水、甲醇-水體系的50%。以甲醇-水為流動相時，雖然目標化合物靈敏度較高，但是不能獲得較好峰形。以乙腈-水為流動相時，目標化合物的峰形最好且靈敏度高。因此，最終確定以乙腈-水為本試驗的洗脫溶劑。ZEN定量離子的MRM圖見圖1。

圖1 ZEN定量離子的MRM圖Fig.1 MRM diagram of quantitative ions of ZEN

2.3 提取溶劑的選擇

本試驗考察了乙腈、甲醇、乙醇作為提取溶劑對檢測結(jié)果的影響。樣品在20 μg/kg的添加濃度下，分別使用乙腈、甲醇、乙醇作提取溶劑，經(jīng)三氯甲烷凈化后采用13C18-Zearalenone做內(nèi)標進行定量。發(fā)現(xiàn)通過內(nèi)標進行校正后，3組檢測數(shù)據(jù)回收結(jié)果相當，均高于90%，但是用乙腈作提取溶劑內(nèi)標物的絕對回收率為72%，甲醇為61%，乙醇為60%，試驗結(jié)果見表3。從最后得到的待測溶液顏色來看，乙腈提取樣品后待測液為澄清透明的微黃色，甲醇和乙醇提取樣品后待測液為黃色，且乙醇提取樣品后待測液顏色最深，說明乙腈起到了較好的去除色素的作用。綜合考慮，最后選擇乙腈作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑對內(nèi)標物回收率的影響Table 3 Effect of different extraction solvents on the recovery rates of internal standard substances

現(xiàn)行國標和文獻中常使用乙腈-水(9+1)[13-14]和乙腈-水(84+16)[15]作為提取溶劑。本試驗首先用乙腈提取目標物，發(fā)現(xiàn)乙腈與醬油完全分層，當在乙腈中加入部分水時，乙腈水提取溶劑會與醬油部分互溶，從而無法確定樣品的稀釋體積。因此，本試驗采用純乙腈作為提取溶劑，渦旋5 min進行充分提取，取得了較好的效果。

2.4 凈化方式的選擇

常用的真菌毒素提取液凈化方式為免疫親和柱凈化法[16-17]及固相萃取小柱凈化法[18]。這兩種方式的凈化效果雖然較好，但存在操作步驟繁瑣、消耗時間長、成本較高等問題，不利于大批量樣品的處理。本試驗采取液-液萃取的方法進行凈化，在提取液中加入三氯甲烷對目標物進行萃取，利用分配系數(shù)差異將乙腈中的目標物進行轉(zhuǎn)移，起到凈化作用。試驗比較了三氯甲烷為1，3，5，7 mL的凈化效率，當采用外標法定量時，目標物的回收率分別為60%、66%、75%、75%。因此，選擇三氯甲烷使用量為5 mL作為萃取用量。

2.5 基質(zhì)效應及內(nèi)標的選擇

本試驗通過比較溶劑匹配標準曲線和基質(zhì)匹配標準曲線的斜率來判定基質(zhì)效應[19]，按下式進行計算：

當ME<-20%時，表現(xiàn)為離子抑制；當-20%≤ME≤20%時，表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應；當ME>20%時，表現(xiàn)為離子增強。

結(jié)果表明，當采用外標法定量時，ME為-47%；當采用內(nèi)標法定量時，ME為-27%，均表現(xiàn)為基質(zhì)效應抑制。

在食品理化分析時，目標物在前處理過程中會有不同程度的損失，在樣品中加入與目標物化學性質(zhì)相近的同位素內(nèi)標，有助于校正樣品的前處理過程，同時也能校正儀器在進樣時引起的誤差。全13C同位素內(nèi)標與目標物有相同的結(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)，且色譜行為一致，基質(zhì)效應相同，在提取時加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標能夠反映樣品前處理的效率，校正進樣體積誤差，對質(zhì)譜離子化效率進行補償，因此本試驗選擇13C18-Zearalenone作內(nèi)標，并采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量。

2.6 線性關(guān)系、檢出限、定量限

對空白基質(zhì)系列標準溶液進樣測定，繪制工作曲線，計算回歸方程。以定量離子信噪比S/N=3時對應的濃度水平為檢出限，以定量離子信噪比S/N=10時對應的濃度水平為定量限，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，在所測線性范圍內(nèi)，ZEN具有良好的線性關(guān)系，檢出限、定量限均優(yōu)于國家標準。

表4 玉米赤霉烯酮標準品回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 4 The regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of ZEN

2.7 回收率及精密度

按試驗方法進行了3個水平的加標回收試驗，每個加標水平平行6次試驗，添加水平及結(jié)果見表5。結(jié)果表明，方法回收率為92.7%～96.0%，相對標準偏差小于3.0%，該方法具有良好的準確度和精密度。

表5 回收試驗結(jié)果(n=6)Table 5 The results of recovery test (n=6)

2.8 樣品的測定

對市售18批醬油以及原料用8批小麥、8批大豆按選定方法進行測定，結(jié)果18批醬油均未檢出ZEN，3批小麥檢出ZEN(3.5～41.3 μg/kg)，4批大豆檢出ZEN(8.2～22.8 μg/kg)，均未超過GB 2761-2017規(guī)定的谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量值60 μg/kg，說明生產(chǎn)企業(yè)在原料把控和生產(chǎn)工藝上控制良好。

對5批空白基質(zhì)樣品添加標準溶液進行基質(zhì)加標試驗，模擬陽性醬油樣本，加標水平為20 μg/kg，通過該方法進行測定，回收率分別為91.5%、98.7%、99.2%、90.6%和96.3%。

3 結(jié)論

本試驗建立了醬油中玉米赤霉烯酮的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，樣品經(jīng)20 mL乙腈提取，5 mL三氯甲烷萃取凈化，用乙腈-水作流動相進行梯度洗脫，在負離子模式下進行多反應監(jiān)測掃描，內(nèi)標法定量測定樣品中玉米赤霉烯酮的含量，該方法玉米赤霉烯酮在5～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率在90%以上，檢出限為0.1 μg/kg。該方法前處理簡單、靈敏度高、重復性好，能有效地滿足醬油中玉米赤霉烯酮的測定。