池塘養(yǎng)殖患病黃顙魚(yú)病毒病原的電鏡觀察初報(bào)

劉文枝，薛明洋，周勇，李逸群，范玉頂，孟彥，曾佳，曾令兵,

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

黃顙魚(yú)Pelteobagrus fulvidraco 肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富、養(yǎng)殖方式多樣（單養(yǎng)、混養(yǎng)、網(wǎng)箱養(yǎng)殖），是我國(guó)廣泛養(yǎng)殖的肉食性為主的雜食性小型名優(yōu)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[1]。我國(guó)黃顙魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2018年總產(chǎn)量達(dá)51 萬(wàn)t[2]。近些年來(lái)，黃顙魚(yú)的病害研究大多集中于細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)等病原[3-11]。2020 年3—4 月浙江湖州、湖北枝江、潛江等黃顙魚(yú)主養(yǎng)區(qū)域發(fā)生黃顙魚(yú)暴發(fā)性疾病，隨后，四川、重慶、湖南、廣西、廣東等地區(qū)相繼暴發(fā)，給黃顙魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)的損失，但病因不明。

2020 年4 月中旬，湖北省潛江市某黃顙魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了黃顙魚(yú)暴發(fā)性死亡，臨床癥狀主要表現(xiàn)為魚(yú)下頜基部出血。該病傳播迅猛，發(fā)病率約40%～60%，死亡率高達(dá)70%～80%，病程一般為3～5 d，發(fā)病水溫20～24℃，抗生素藥物治療無(wú)效。本文對(duì)典型患病黃顙魚(yú)組織樣本進(jìn)行了超薄切片和電鏡觀察，旨在為黃顙魚(yú)疾病的病原學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

患病黃顙魚(yú)于2020 年4 月采自湖北省潛江市某黃顙魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)，病魚(yú)體質(zhì)量約為20～30 g。選取瀕死、下頜出血的患病黃顙魚(yú)脾臟、腎臟等組織器官固定在2.5%戊二醛溶液中，用于超薄切片電鏡觀察。

1.2 電子顯微鏡切片的制備與觀察

從固定液中取出約1 mm3的組織塊，以體積分?jǐn)?shù)為1%的OSO4（pH7.2）固定1～2 h。隨后置于乙醇-丙酮中進(jìn)行序列脫水，環(huán)氧樹(shù)脂Epon812 浸透包埋。用超薄切片機(jī)（Leica UC7，Germany）進(jìn)行超薄切片，將切片用鈾和鉛聯(lián)合染色后，用透射電子顯微鏡（Hitachi-7650,Japan）觀察[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病黃顙魚(yú)臨床癥狀

患病黃顙魚(yú)頭部、口腔、鰓蓋及下頜基部出血（圖1-A）。解剖發(fā)現(xiàn)：患病黃顙魚(yú)脾臟充血，腎臟腫大，彌散性壞死（圖1-B、圖1-C）。

圖1 患病黃顙魚(yú)的臨床癥狀Fig.1 Gross pathological signs of diseased yellow catfish

2.2 電鏡觀察

透射顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，患病黃顙魚(yú)組織中細(xì)胞病變明顯，細(xì)胞核固縮或染色質(zhì)邊緣化，脾臟和腎臟組織內(nèi)有大量的球形病毒樣顆粒。這些球形病毒顆粒無(wú)囊膜，直徑約30～40 nm（圖2-C、圖2-F）；病毒粒子分布在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，有的由單位膜包裹在包涵體中（圖2-D），而正常黃顙魚(yú)組織中未觀察到球形樣病毒顆粒（圖2-A、圖2-B）。

圖2 患病黃顙魚(yú)脾臟和腎臟組織球形病毒顆粒電鏡觀察Fig.2 Spherical virus-like particles in the spleen and kidney of the diseased yellowd catfish under transmission electron microscopy

3 討論

近幾年，我國(guó)黃顙魚(yú)養(yǎng)殖發(fā)展迅速，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，黃顙魚(yú)病害也越來(lái)越突出。但是，目前對(duì)黃顙魚(yú)疾病的研究較少，僅有的報(bào)道主要集中在細(xì)菌性病原[3-8]。周勇等[3]從體表患典型腹水病的黃顙魚(yú)肝臟中分離鑒定出維氏氣單胞菌Aeromonas veronii，病魚(yú)的主要癥狀是腹部膨大，腹腔內(nèi)含有大量積水，無(wú)鰭條充血癥狀。張濤等[4]通過(guò)病理組織分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)患腹水病黃顙魚(yú)鰓、肝、脾、腎、胃、腸等組織器官均發(fā)生不同程度病變，病原菌對(duì)魚(yú)體各部位的組織功能均造成一定影響，其中腎組織病變嚴(yán)重。愛(ài)德華氏菌Edwardsiella ictaluri 感染的養(yǎng)殖黃顙魚(yú)主要癥狀為頭頂部皮下充血、發(fā)紅、潰爛，病情嚴(yán)重的頭骨裂開(kāi)，暴露出腦組織[5,6]。胡宗云等[7]在患“紅頭病”的黃顙魚(yú)體內(nèi)分離到病原菌為蠟狀芽孢桿菌。2015 年江蘇淮安地區(qū)暴發(fā)的養(yǎng)殖黃顙魚(yú)出血性腸炎病原鑒定為嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila[8]。葉仕根等[9,10]報(bào)道，在人工養(yǎng)殖黃顙魚(yú)過(guò)程中還會(huì)出現(xiàn)真菌性疾病感染，如水霉病和鰓霉病。寄生蟲(chóng)疾病也偶有報(bào)道[11]。

本研究中患病黃顙魚(yú)主要癥狀為頭部、口腔、鰓蓋和下頜基部有明顯出血現(xiàn)象；解剖內(nèi)臟發(fā)現(xiàn)脾臟、腎臟等器官出現(xiàn)嚴(yán)重病變。但病魚(yú)的體表光滑，頭部無(wú)穿孔現(xiàn)象，腹腔內(nèi)亦無(wú)腹水。本研究也開(kāi)展了細(xì)菌分離研究，但未分離到以上所報(bào)道的細(xì)菌病原，也未觀察到真菌病原。在光學(xué)顯微鏡下觀察，僅鰓部有少量車(chē)輪蟲(chóng)寄生，但它不是引起黃顙魚(yú)死亡的主要病因。本文所采集的患病黃顙魚(yú)的養(yǎng)殖場(chǎng)在使用殺蟲(chóng)藥和抗生素后，發(fā)病情況未見(jiàn)改善。

黃顙魚(yú)病毒性疾病的研究鮮有報(bào)道。2019 年Zhang 等[13]在患病的黃顙魚(yú)體內(nèi)分離到一種桿形病毒。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，該病原與水生動(dòng)物的白鳊病毒（white bream virus,WBV）有一定同源性。但是，由于缺乏病毒在感染黃顙魚(yú)組織上的超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察結(jié)果，其致病機(jī)理尚不清晰。本研究在患病黃顙魚(yú)的腎臟、脾臟等組織中首次觀察到了球形病毒樣顆粒，根據(jù)其形態(tài)、大小及存在形式等特征，推測(cè)球形病毒顆粒與小RNA 病毒科成員相似，但要準(zhǔn)確確定其分類(lèi)地位尚需要大量的生物學(xué)和分子生物學(xué)鑒定工作。目前，關(guān)于該病毒病原的病原學(xué)、流行病學(xué)、分子檢測(cè)等工作正在開(kāi)展之中。黃顙魚(yú)病毒病原的發(fā)現(xiàn)，可為黃顙魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中暴發(fā)性流行病的病原學(xué)、流行病學(xué)、免疫和防控技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)本研究的初步結(jié)果，建議黃顙魚(yú)養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)于病毒性疾病應(yīng)以預(yù)防為主，合理控制養(yǎng)殖密度和飼料投喂量，以降低黃顙魚(yú)病毒性疾病的發(fā)生率。