大孔吸附樹脂吸附-解析古漢養(yǎng)生多糖工 藝 研 究*

鐘 源，趙夢(mèng)姣，彭?xiàng)澚?，陽佑華，謝 康，李佳聰，劉 芳

（1.古漢中藥有限公司，湖南 衡陽 421003；2.湖南省中藥液體制劑工程技術(shù)研究中心，湖南 衡陽 421003）

多糖是由至少10個(gè)醛糖或酮糖通過苷鍵結(jié)合在一起的高分子碳水化合物，在高等植物、藻類、菌類及動(dòng)物體內(nèi)均有存在，是自然界含量最豐富的生物聚合物之一。多糖具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗病毒等[1-5]藥理作用，在醫(yī)藥及保健品研發(fā)領(lǐng)域有較多的研究與應(yīng)用，當(dāng)前已有黃芪多糖、香菇多糖注射液、紫芝多糖片等眾多產(chǎn)品問世。

古漢養(yǎng)生多糖為古漢養(yǎng)生精醇沉工序中沉淀下來的混合粗多糖，其中包括黃精多糖、枸杞多糖、黃芪多糖、淫羊藿多糖、金櫻子多糖等，干燥粉碎后呈棕褐色粉末，溶于熱水、低濃度乙醇，在50%（V/V）以上的乙醇溶液中開始沉淀，在硫酸的作用下可水解，并迅速生成糖醛衍生物，加入苯酚即顯橙黃色化。大量的研究已證實(shí)，上述多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等[6-9]功效。目前，古漢養(yǎng)生精產(chǎn)量大，年產(chǎn)醇沉粗多糖100噸以上，利用價(jià)值可觀，將此部分粗多糖分離純化、制劑成新產(chǎn)品可為企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

目前，利用大孔樹脂層析法去除粗多糖中的蛋白質(zhì)、色素的研究較多，且效果較好。大孔樹脂層析技術(shù)具有吸附量大、易解析、選擇性好、重復(fù)利用等特點(diǎn)，在醫(yī)藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，尤其在天然產(chǎn)物的提取、分離純化方面的應(yīng)用尤為突出，并逐漸顯現(xiàn)出其優(yōu)越性。近年來，NAK-20、LSA-5B、D101、AB-8、HPD-100等樹脂廣泛應(yīng)用于中藥多糖的研究，分離純化黃精多糖、枸杞多糖、甘草多糖的效果明顯，顯著優(yōu)于其他樹脂[10-12]。因此，本研究擬選用NAK-20、LSA-5B、D101、AB-8、HPD-100、X-5、H103共7種大孔樹脂層析法對(duì)古漢養(yǎng)生多糖進(jìn)行吸附-解析實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化樹脂吸附-解析工藝參數(shù)，以期為進(jìn)一步分離純化古漢養(yǎng)生多糖、開發(fā)高附加值產(chǎn)品提供前期基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 古漢養(yǎng)生醇沉粗多糖取自古漢中藥有限公司口服液提取車間；D101、AB-8、HPD-100、LSA-5B樹脂（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；X-5、H103、NAK-20樹脂（天津南開大學(xué)樹脂有限公司）；葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度≥99.8%，批號(hào)：110833-210908）；苯酚（湖南匯虹試劑有限公司，AR分析純，批號(hào)：20190711），硫酸（衡陽市凱信化工試劑股份有限公司，AR分析純，批號(hào)：20180605）；乙醇（湖南匯虹試劑有限公司，AR分析純，批號(hào)：20191008）；Lambda35型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)PerkinELmer公司）。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理 車間取古漢養(yǎng)生醇沉粗多糖，回收酒精，60℃烘干至恒重，粉碎，密封保存待用。稱取粗多糖粉末100 g，加水2 L，煮沸30 min，過濾，離心（3000 r/min，40 min），取上清液，定容至10 L，即為粗多糖溶液。試驗(yàn)中根據(jù)需要對(duì)粗多糖溶液進(jìn)行稀釋。

1.2.2 多糖檢測(cè)[13]（苯酚—硫酸法）（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精確稱取無水葡萄糖對(duì)照品3.03 mg，置100 mL容量瓶中，加水適量溶解，定容至刻度，搖勻。精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置具塞試管中，分別加水補(bǔ)至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品多糖測(cè)定：精密量取試驗(yàn)樣品溶液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。精密量取多糖稀釋樣品2.0 mL，置具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖濃度。

1.2.3 樹脂預(yù)處理及再生 新購(gòu)買的D101、AB-8、HPD-100、LSA-5B、X-5、H103、NAK-20樹脂用水洗去除懸浮物及水溶性雜質(zhì)后，乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，再以乙醇濕法裝入玻璃層析柱，蒸餾水洗至流出液與水混合不渾濁，2% NaOH溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至流出液呈中性，再用2%HCl溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至流出液中性。

1.2.4 樹脂靜態(tài)吸附-解析試驗(yàn) 稱取經(jīng)預(yù)處理的7種樹脂各10.0 g于100 mL的錐形瓶中，分別加入30 mL的粗多糖溶液，25℃恒溫振搖24 h，振搖頻率120 r/min。振搖結(jié)束之后，濾紙過濾粗多糖溶液，定容至50 mL，再稀釋100倍，按“1.2.2”方法檢測(cè)多糖濃度，計(jì)算各樹脂多糖吸附率。

分離出來的樹脂置于100 mL的錐形瓶中，加入30%（V/V）乙醇100 mL，25℃恒溫振搖24 h，振搖頻率120 r/min。振搖結(jié)束之后，濾紙過濾解析液，定容至50 mL，再稀釋100倍，按“1.2.2”方法檢測(cè)多糖濃度，計(jì)算各樹脂多糖解析率。

吸附率（%）=[C1×V1/（C×V）×100%，解析率（%）]=[C2×V2/（CV-C1V1）]×100%。

式中，C、C1、C2分別為上樣液（粗多糖溶液）多糖濃度，吸附之后的溶液多糖濃度，解析液多糖濃度；V、V1、V2分別為上樣液體積，吸附之后的溶液定容體積，解析液定容體積。

1.2.5 樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解析試驗(yàn)

1.2.5.1 上樣濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響 量取經(jīng)預(yù)處理的NAK-20樹脂50 mL 4份，濕法裝入4根玻璃層析柱內(nèi)，分別以0.46、0.91、1.81、3.62 mg/mL的粗多糖溶液上樣，上樣流速3 BV/h（1 BV=50 mL），上樣體積4 BV。按“1.2.2”方法檢測(cè)流出液多糖濃度，計(jì)算樹脂吸附量，確定最佳上樣濃度。

1.2.5.2 上樣體積對(duì)樹脂吸附效果的影響 量取經(jīng)預(yù)處理的NAK-20樹脂50 mL，濕法裝入玻璃層析柱內(nèi)，以1.81 mg/mL的粗多糖溶液上樣，上樣流速3 BV/h，上樣體積4 BV，依次收集流出液，每個(gè)樣品50 mL。按“1.2.2”方法檢測(cè)流出液樣品的多糖濃度，確定最佳上樣體積。

1.2.5.3 上樣流速對(duì)樹脂吸附效果的影響 量取經(jīng)預(yù)處理的NAK-20樹脂50 mL 3份，濕法裝入3根玻璃層析柱內(nèi)，以1.81 mg/mL的粗多糖溶液上樣，上樣體積2 BV，上樣流速分別為1、2、3、4 BV/h，分別收集流出液。按“1.2.2”方法檢測(cè)吸附流出液的多糖濃度，計(jì)算樹脂吸附率，確定最佳上樣流速。

1.2.5.4 解析溶液濃度對(duì)解析效果的影響 按實(shí)驗(yàn)“1.2.5.1”“1.2.5.2”“1.2.5.3”確定的NAK-20樹脂吸附條件進(jìn)行上樣，進(jìn)行4組試驗(yàn)，每組分別用4 BV的10%、20%、30%、40%（V/V）乙醇進(jìn)行解析，解析流速2 BV/h，分別收集不同濃度乙醇解析下的解析液。按“1.2.2”方法檢測(cè)吸附流出液和解析液的多糖濃度，計(jì)算多糖解析率，確定最佳解析液濃度。

1.2.5.5 解析溶液用量對(duì)解析效果的影響 按實(shí)驗(yàn)“1.2.5.1”“1.2.5.2”“1.2.5.3”確定的樹脂吸附條件進(jìn)行上樣，再以10%（V/V）乙醇為解析液進(jìn)行解析實(shí)驗(yàn)，解析體積4 BV，解析流速2 BV/h，每50 mL解析液收集為一個(gè)樣品。按“1.2.2”方法檢測(cè)吸附流出液和解析液樣品的多糖濃度，計(jì)算多糖解析率，確定最佳解析液體積。

1.2.5.6 解析流速對(duì)解析效果的影響 按實(shí)驗(yàn)“1.2.5.1”“1.2.5.2”“1.2.5.3”確定的樹脂吸附條件進(jìn)行4根玻璃層析柱上樣，再以10%（V/V）乙醇為解析溶液進(jìn)行解析實(shí)驗(yàn)，解析流速分別為1、2、3、4 BV/h，解析體積均為2 BV。按“1.2.2”方法檢測(cè)吸附流出液和各解析液的多糖濃度，計(jì)算多糖解析率，確定最佳解析流速。

1.2.5.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按實(shí)驗(yàn)“1.2.5.1”“1.2.5.6”確定的參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)吸附流出液和解析液的多糖濃度，計(jì)算NAK-20樹脂對(duì)古漢養(yǎng)生精多糖的吸附率和解析率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 見圖1。

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 靜態(tài)吸附-解析試驗(yàn)結(jié)果 見表1。

表1 7種大孔吸附樹脂對(duì)古漢養(yǎng)生多糖靜態(tài)吸附-解析的效果

由表1的數(shù)據(jù)可知，7種樹脂中H103H和NAK-20對(duì)古漢養(yǎng)生多糖的靜態(tài)吸附效果較好，吸附率分別為62.50%、66.76%，其中NAK-20的解析效果更好，解析率達(dá)到78.56%。因此，動(dòng)態(tài)吸附-解析試驗(yàn)選用NAK-20樹脂，優(yōu)化NAK-20樹脂吸附-解析古漢養(yǎng)生多糖工藝參數(shù)。

2.3 動(dòng)態(tài)吸附-解析試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 上樣濃度對(duì)樹脂多糖吸附效果的影響 見圖2。

圖2 上樣濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響

從圖2可知，NAK-20樹脂對(duì)古漢養(yǎng)生多糖的吸附量隨著上樣濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。上樣濃度為1.81 mg/mL，吸附量達(dá)到8.35 mg/mL；當(dāng)上樣濃度再增加時(shí)，吸附量反而下降。因此，最佳上樣濃度為1.81 mg/mL。

2.3.2 上樣體積對(duì)樹脂多糖吸附效果的影響 見圖3。

圖3 NAK-20樹脂上樣飽和曲線

圖3所示，NAK-20樹脂以1.81 mg/mL的粗多糖溶液上樣，隨著上樣體積的增加，流出液收集樣品多糖濃度明顯升高；當(dāng)上樣第3 BV時(shí)，收集樣品多糖濃度已到達(dá)1.37 mg/mL，說明此時(shí)NAK-20樹脂已達(dá)到吸附飽和。因此，NAK-20樹脂吸附古漢養(yǎng)生多糖的最佳上樣體積為2 BV。

2.3.3 上樣流速對(duì)樹脂多糖吸附效果的影響 見圖4。

圖4 上樣流速對(duì)NAK-20樹脂吸附效果的影響

樹脂吸附上樣流速過快，目標(biāo)組分可能來不及吸附就流出；流速過慢，雜質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性吸附可能較強(qiáng)，同時(shí)吸附效率不高，不利于工業(yè)化大生產(chǎn)。圖4所示，隨著上樣流速的增大，NAK-20樹脂吸附率先增大后降低，流速為3 BV/h時(shí)，吸附效果最佳，達(dá)到79.05%。因此，NAK-20樹脂吸附古漢養(yǎng)生多糖的最佳上樣流速為2.5 BV/h。

2.3.4 解析液濃度對(duì)多糖解析效果的影響 見圖5。

圖5 解析溶液乙醇濃度對(duì)多糖解析效果的影響

多糖一般在30%以下的乙醇或熱水中溶解較好，柱層析中常用30%及以下的乙醇作為解析劑，能取得很好的解析效果[14-15]。動(dòng)態(tài)試驗(yàn)對(duì)比研究了10%、20%、30%、40%乙醇的解析效果，如圖5所示，隨著乙醇濃度的增大，多糖解析率逐漸降低，4 BV 10%乙醇解析多糖解析率能達(dá)到81.38%，證明以10%乙醇為解析溶液解析效果較好。

2.3.5 解析溶液用量對(duì)多糖解析效果的影響 見圖6。

圖6 解析溶液用量對(duì)多糖解析效果的影響

圖6所示，隨著解析溶液用量的增加，古漢養(yǎng)生多糖解析率增大。當(dāng)解析溶液用量為2 BV時(shí)，解析率達(dá)到79.03%，再增加解析溶液用量解析率變化不明顯，考慮到經(jīng)濟(jì)效益，故選擇解析溶液用量為2 BV。

2.3.6 解析流速對(duì)多糖解析效果的影響 見圖7。

解析流速（BV/h）圖7 解析流速對(duì)古漢養(yǎng)生多糖解析效果的影響

解析流速太慢，樹脂對(duì)多糖的競(jìng)爭(zhēng)性吸附作用較大，不利于多糖解析下來；流速過快，多糖還來不及被解析下來，解析溶液已流出。從圖7的趨勢(shì)可以看出，隨著解析流速的增大，古漢養(yǎng)生多糖解析率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)解析流速為2 BV/h，解析率達(dá)到85.38%，解析效果最好。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照實(shí)驗(yàn)“2.3”確定的NAK-20樹脂吸附-解析工藝參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，NAK-20樹脂對(duì)古漢養(yǎng)生多糖的吸附率分別為68.94%、67.77%、70.01%，解析率分別為86.23%、82.36%、85.88%，平均吸附率和解析率分別為68.91%、84.82%。實(shí)驗(yàn)證明，NAK-20樹脂對(duì)古漢養(yǎng)生多糖的吸附-解析效果較好，工藝參數(shù)穩(wěn)定。

3 小 結(jié)

古漢養(yǎng)生多糖為復(fù)合純中藥多糖類物質(zhì)，其中含有淫羊藿多糖、黃精多糖、枸杞多糖等。多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜。目前多糖定量分析方法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，筆者采用苯酚-硫酸法對(duì)多糖含量進(jìn)行檢測(cè)，利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，該化合物在490 nm波長(zhǎng)處有特征吸收。

大孔吸附樹脂是一類不含交換基團(tuán)且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可以有選擇地通過物理吸附水溶液中的有機(jī)物。實(shí)驗(yàn)選用了NAK-20等7種大孔吸附樹脂對(duì)醇沉粗多糖進(jìn)行研究吸附-解析研究，在靜態(tài)吸附試驗(yàn)篩選樹脂的基礎(chǔ)上，對(duì)NAK-20樹脂的動(dòng)態(tài)吸附-解析試驗(yàn)進(jìn)行了工藝參數(shù)優(yōu)化，得到的最佳工藝參數(shù)為：上樣液多糖濃度1.81 mg/mL，上樣體積2 BV，上樣流速3 BV/h；解析溶液為10%乙醇，解析溶液用量2 BV，解析流速2 BV/h。吸附率和解析率分別達(dá)到68.91%、84.82%，效果較好。

實(shí)驗(yàn)未對(duì)古漢養(yǎng)生精多糖中蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)的脫除情況進(jìn)行考察，多糖純度未進(jìn)行深入分析，這是本研究存在的不足之處，也是后期研究的方向。利用現(xiàn)代分離純化技術(shù)提高古漢養(yǎng)生多糖的純度，并以此開發(fā)保健食品、藥品等，能達(dá)到變廢為寶、提升企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的目的。