張 楨，周志疆，趙敏蓉，程立寶*

（1.江蘇豐收大地種業(yè)發(fā)展有限公司 江蘇，鹽城 224000；2.揚州大學園藝與植物保護學院 江蘇，揚州 225009）

紅薯（IpomoeabatatasLam.）別稱地瓜、紅苕、甘薯、朱薯、紅山藥等[1]，一年生草本植物。中國大多數地區(qū)普遍種植，其中，蘇北地區(qū)是江蘇省紅薯主產區(qū)之一。紅薯是一種營養(yǎng)豐富、適應性強的高產糧食作物，口感甘甜，因其富含淀粉、胡蘿卜素、膳食纖維、花青素、維生素和鉀、鐵、銅、硒、鈣等 10 余種微量元素以及8 種氨基酸[2]，被譽為最均衡的健康食品。

紅薯一旦感染病毒病后，常常導致其種性嚴重退化、品質和產量下降，通常單產降低20%-50%，每年將產生高達幾十億元的經濟損失。目前，影響薯類作物生長的病毒病有30余種，其中羽狀斑駁病毒(SPFMV)、花椰菜花葉病毒（SPCMV）、潛隱病毒(SPLV)、花脈病毒（SPVMV）和G毒病(SPVG)是主要的病毒病[3]，并且有2種或2種以上病毒混合感染現象。本文主要介紹利用莖尖培養(yǎng)結合化學方法提純復壯鮮食紅薯的方法。

1 品種的選擇及預處理

1.1 品種選擇

選擇性狀優(yōu)良，具有發(fā)展?jié)摿Φ牡胤狡贩N進行栽培。田間種植過程中，挑選具有該品種典型性狀，尤其是品相好、口感香甜軟糯，水分適中的單株（一般是塊根）作為脫毒對象。

1.2 品種預處理

將鮮食紅薯營養(yǎng)器官放在37℃的催芽箱內進行催芽（主要為了讓病毒失去活力和傳染性），時間約為30天。

2 紅薯莖尖脫毒培養(yǎng)技術

2.1 外植體的處理

選取0.5-2cm生長健康、無病斑并且莖尖飽滿的紅薯植株頂芽或腋芽，先用自來水沖洗表面雜質后，接著用蘸有適量次氯酸鈉的刷子進行全面清洗，再用自來水沖洗2-3遍備用。所取材料在超凈工作臺上進行三步法消毒：首先將外植體浸泡在75%的酒精中60s進行表面消毒，用無菌水沖洗2-3遍，接著將其浸泡在愛力克新型消毒泡騰片溶液（A、B各一片溶解在1L無菌水）中10-20min，用無菌水沖洗2-3遍，充分洗凈后再用2%次氯酸鈉或0.1%升汞消毒處理30min，用無菌水沖洗5-8 遍后，將其放置于帶有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，吸干水分備用。

2.2 紅薯莖尖分生組織培養(yǎng)

2.2.1 莖尖培養(yǎng)基的配制 紅薯莖尖分生組織培養(yǎng)基以MS 為基本培養(yǎng)基，附加30g/L-40g/L 蔗糖和6.0g/L 瓊脂，添加的激素比例為0.15mg/L IAA和0.15mg/L 6-BA，調節(jié)pH 值為6.0，如果增添0.05mg/L GA3 可以加速成苗。培養(yǎng)基配制完成后分裝，每管裝10ml培養(yǎng)液，用耐高溫組培封口膜密封，放置于高壓滅菌鍋中121℃高壓滅菌30min，滅菌結束后待培養(yǎng)基冷卻凝固后使用。

2.2.2 莖尖剝離 在超凈工作臺上，將消毒后的莖尖放置在解剖顯微鏡下，用解剖針剝離紅薯芽的頂端外層組織，其中需要注意的是剝一層換一個解剖針。最后切取0.5-0.7mm的莖尖分生組織（通常帶有2個葉原基），并將切下的莖尖分生組織尖端面朝上放置于培養(yǎng)基上。在莖尖剝離后，應盡快完成接種環(huán)節(jié)，減少暴露時間，以防莖尖變干。

2.2.3 莖尖培養(yǎng)條件 將切下的莖尖迅速接種于分化培養(yǎng)基（MS+0.15mg/L IAA+0.15mg/L 6-BA+0.05mg/L GA3）中。溫度設置在25℃-28℃，光強2000lx，每日光照12h 處理條件下培育誘導芽的形成，30d 換一次培養(yǎng)基。在培養(yǎng)期間，采集組培苗葉片提取DNA及RNA，采用RTPCR或者紅薯病毒芯片快速檢測方法檢測紅薯中的主要病毒，如PFMV、SPCSV、SPLV 和SPVG 等，剔除無效組培苗，獲得鮮食紅薯脫毒苗，進入快繁階段。

2.2.4 脫毒苗快繁 經過病毒檢測后，可以將健壯的脫毒試管苗在培養(yǎng)室內進行切斷快速繁殖或者栽植在營養(yǎng)缽中。

①切斷快速繁殖：在無菌條件下，將脫毒試管苗植株莖干切割成小段，每一個小段一個芽點，分別接入到培養(yǎng)基（MS 或1/2MS 培養(yǎng)基，加入0.2mg/L 的6-BA，0.1mg/L 的NAA，3%的蔗糖）中，pH 調6.0 左右。在溫度26℃-28℃，光強2000-3000lx，每天光照14h條件下，生長周期30d，繁殖系數可達7n左右，脫毒苗可在一定時間內大量繁殖。

②營養(yǎng)缽栽植：營養(yǎng)缽中的基質配比為泥炭:蛭石:珍珠巖=1:1:1 或 2:1:1，pH 調至 6.0 左右[4]。接著從試管中取出長成5-7片葉片的脫毒苗，用無菌水輕輕沖洗殘留在根系的培養(yǎng)基后，將幼苗種植在裝有滅菌基質的營養(yǎng)缽中，練苗并培養(yǎng)20d左右。當幼苗長至7-9片葉時，將它們移植到40目防蟲網室中，當年收獲的薯塊為脫毒原原種。

3 脫毒鮮食紅薯的移栽馴化

將脫毒苗移栽至地勢高而干燥、通風良好、土壤肥沃疏松的溫室內馴化，并且該溫室至少要在3年內不種植紅薯且不會在土壤中傳播諸如根腐，黑斑和莖線蟲的病害。溫室上、下出風口及入口設60目防蟲網，入口設2扇防蟲紗門。育苗畦畦寬120-150cm。將準備好的苗圃土壤鋪在邊界上，厚度為10cm，土壤含水量維持15%-25%。將生長旺盛且在培養(yǎng)室中生長35-40d的無病毒幼苗在溫室中培養(yǎng)1d，接著全部打開培養(yǎng)瓶蓋并馴化2-3d，然后移栽到行距8cm、株距5cm 的苗床上。幼苗定植后，應及時澆灌定根水，再用800-1000倍液的百菌清或多菌靈噴淋，然后搭小拱棚并蓋上遮陽網。苗棚溫度應維持在25℃-32℃，每天澆水1次，保持土壤濕潤，5-7d后去膜，一般成活率可達98%以上。

在揭開薄膜后的12d 內，噴800-1000 倍液的75%百菌清可濕性粉劑或600-800 倍液的50%多菌靈可濕性粉劑。每10-15d 噴一次2000 倍液的10%吡蟲啉可濕性粉劑和50mL/畝的19%溴氰菊酯。溫室內可懸掛黃色粘蟲板來防治蚜蟲，煙粉虱等害蟲，粘蟲板高出紅薯苗15-20cm。黃板數量可按照每畝25-30塊25cm×30cm或30-35塊20cm×30cm標準設置。

4 脫毒原原種苗繁殖

將脫毒試管苗及其擴繁苗種植在防蟲網室內，所結的種薯為脫毒紅薯原原種。脫毒紅薯原原種的生產需要滿足三個條件：首先，確保幼苗無病毒；其次，種植在40目（孔徑0.351mm）以上的防蟲網室內；最后，確保栽植地的土壤不含病源[5]。在滿足以上三個條件同時，還需種植指示植物，通過觀察指示植物的變化來確認種薯的使用等級。在收獲原原種前，應先觀察每棵植物上是否有病毒癥狀，一旦發(fā)現患病植株，為了確保原原種的質量，立即將其移除。

5 脫毒原種苗繁殖

用脫毒紅薯原原種苗在500m 內無普通紅薯種植的空間隔離條件下栽植所結種薯為脫毒紅薯原種。在進行脫毒紅薯原種育種時，種植田周圍應種植少量指示植物，通過觀察指示植物的變化來確認有無病源。如果發(fā)生蚜蟲傳播，應降級使用種薯。為了提高繁殖倍數，可利用溫室、溫床、大棚等建苗圃繁殖苗木。