王軍岐 賈 永 申駿龍 駱 晴

食管癌是一種全球范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全球致病性病因中位居前列。近年來，數(shù)據(jù)顯示每年大約有50萬例患者死于食管癌，約占消化系統(tǒng)惡性腫瘤死亡總數(shù)的1/4，嚴(yán)重危害人類健康[1]。該病確診患者的病情多數(shù)為癌癥晚期，目前的治療手段較為局限，且預(yù)后較差。為提高食管癌患者的預(yù)后生存率，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)大力開展與食管癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)基因的分子靶點(diǎn)治療研究，實(shí)現(xiàn)早期診斷。miRNA可調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，每一個(gè)miRNA都具有多個(gè)靶基因，miRNA調(diào)控著人類約1/3的基因。已有研究表明，miR-503在不同腫瘤中呈現(xiàn)出多樣化作用，如miR-503在肝細(xì)胞癌[2]、結(jié)直腸癌[3]、子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)[4]，而在甲狀旁腺腫瘤[5]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[6]中表達(dá)上調(diào)，但其在食管癌中的研究較少。鈣黏蛋白(E-cadherin)即上皮型鈣黏蛋白，屬于鈣黏蛋白家族中的經(jīng)典鈣黏亞族，主要分布于上皮細(xì)胞表面，是形成細(xì)胞間黏附連接、維持細(xì)胞極性和組織完整性的主要分子。有諸多研究結(jié)果顯示，E-cadherin能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子[7]。且有研究發(fā)現(xiàn)[8]，miR-503-3p在乳腺癌組織和血漿中高表達(dá)，可通過直接靶向E-cadherin促進(jìn)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究將檢測miR-503、E-cadherin在食管癌中的表達(dá)，并初步分析二者與食管癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013-09—2015-03在寶雞市中心醫(yī)院胸外科接受外科手術(shù)治療的食管癌患者119例作為研究對象，并收集術(shù)中切除的食管癌組織和癌旁正常組織。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)首次確診并行食管癌根治術(shù)；(3)臨床資料完整；(4)對本研究內(nèi)容知情，自愿參加本次試驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前行新輔助治療；(2)伴感染或合并自身免疫性疾??；(3)失訪和無術(shù)前白蛋白記錄者。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，所有研究對象或家屬簽署知情同意書，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑與儀器

山羊抗兔單克隆抗體(批號(hào)：20120526)、免疫組化SP染色試劑盒(批號(hào)：20111204X)、DAB顯色試劑盒(批號(hào)：20130415)購自碧云天生物科技有限公司；蘇木素染色液(批號(hào)：20120819)購自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒(批號(hào)：20110921)購自于北京天根生化有限公司；miScript SYBR?Green qPCR Kit(批號(hào)：20121023)購自德國QIAGEN公司；U6引物購自abcam公司；其它引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：CFX96)購自美國Bio-Rad公司。病理組織脫水機(jī)(型號(hào)：TP1020)、石蠟包埋機(jī)(型號(hào)：EG1150)、石蠟切片機(jī)(型號(hào)：RM2235)購自德國Leica公司。

1.3 主要研究方法

1.3.1 免疫組化法檢測食管組織中E-cadherin表達(dá)：癌組織和癌旁正常組織切片經(jīng)二甲苯和遞減酒精梯度脫蠟、水化后，采用0.01M枸櫞酸鈉緩沖液(pH為6.0)于微波爐中進(jìn)行高溫抗原修復(fù)30min；冷卻后加入3%過氧化氫以滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育10min；洗滌后加入1%牛血清白蛋白，室溫下封閉30min；棄去封閉液后將稀釋好的一抗滴加至組織切片上，4℃孵育過夜；洗滌后加入二抗37℃環(huán)境下孵育35min，加入辣根過氧化物酶，經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染；遞增酒精濃度梯度溶液脫水、二甲苯溶液透明后，采用中性樹脂封片，于倒置顯微鏡下進(jìn)行鏡檢并拍照。一抗均按1∶100稀釋，二抗為1∶800。結(jié)果判定：采用雙盲法，由兩位資深病理科醫(yī)師觀察每張切片后作出判定。根據(jù)免疫組化顯色情況進(jìn)行評(píng)分，無色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：陰性計(jì)為0分，1%—10%計(jì)1分，11%—50%計(jì)2分，51%—75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。用染色強(qiáng)度得分和陽性細(xì)胞數(shù)得分的乘積作為該樣本中E-cadherin表達(dá)積分，將積分≥3分設(shè)為E-cadherin表達(dá)陽性[10]。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測組織中miR-503的相對表達(dá)量：取凍存癌組織和癌旁正常組織，進(jìn)行超聲勻漿，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒提供的說明書進(jìn)行提取組織中總RNA，在260、280nm處分別測定RNA溶液吸光度(A)值，測算RNA溶液的濃度和純度，選取A260/A280結(jié)果在1.8—2.0之間者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然后逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為20μl，反應(yīng)條件：37℃ 60min，95℃ 5min。將合成的cDNA放置在-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。最后采用?shí)時(shí)熒光定量PCR儀對miR-503進(jìn)行擴(kuò)增：反應(yīng)體系共10μl：miScript SYBR?Green Mix 5μl，cDNA(50ng/μl)1μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，ddH2O 3.0μl。反應(yīng)條件：95℃ 90s；95℃ 30s；63℃ 30s；72℃ 15s；40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法表示miR-503相對表達(dá)量。miR-503及內(nèi)參引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.4 隨訪

所有患者均通過門診定期復(fù)查或電話隨訪，隨訪開始于治療結(jié)束后，每6個(gè)月隨訪一次，隨訪時(shí)間截止于2020-03，無失訪病例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 食管組織中E-cadherin表達(dá)積分和陽性表達(dá)率

與癌旁正常組織比較，食管癌組織中E-cadherin陽性表達(dá)率、表達(dá)積分均顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 食管組織中E-cadherin表達(dá)情況比較

2.2 食管組織中miR-503相對表達(dá)量

與癌旁正常組織比較，食管癌組織中miR-503相對表達(dá)量顯著上升(P<0.01)。見表3。

表3 食管組織中miR-503相對表達(dá)量比較

2.3 不同病理特征食管癌組織中miR-503表達(dá)水平和E-cadherin表達(dá)積分

食管癌組織中miR-503、E-cadherin表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05)；與浸潤深度T1+T2、TNM分期Ⅰ+Ⅱ、高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，浸潤深度T3+T4、TNM分期Ⅲ+Ⅳ、中和低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-503相對表達(dá)量顯著上升，而E-cadherin表達(dá)積分顯著降低(P<0.01)。見表4。

表4 不同病理特征食管癌組織中miR-503、E-cadherin的表達(dá)

2.4 食管癌組織中miR-503表達(dá)與E-cadherin表達(dá)積分的相關(guān)性

Pearson法分析顯示，食管癌組織中miR-503表達(dá)與E-cadherin表達(dá)積分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.517，P<0.01)。

2.5 miR-503、E-cadherin表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系

以食管癌組織中miR-503相對表達(dá)量的平均值(1.37)為界分為miR-503高表達(dá)(≥1.37，78例)和miR-503低表達(dá)(<1.37，41例)，以食管癌組織中E-cadherin表達(dá)積分的平均值(4.11分)為界分為E-cadherin高表達(dá)(≥4.11分，49例)和E-cadherin低表達(dá)(<4.11分，70例)。采用Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-503高表達(dá)者5年累積生存率(42.31%，33/78)低于miR-503低表達(dá)者(65.85%，27/41)(χ2=4.962，P<0.05)；食管癌組織中E-cadherin高表達(dá)者5年累積生存率(79.59%，39/49)高于E-cadherin低表達(dá)者(30.00%，21/70)(χ2=25.803，P<0.01)。見圖1、圖2。

圖1 不同miR-503表達(dá)水平患者5年生存率比較

圖2 不同E-cadherin表達(dá)積分患者5年生存率比較

3 討 論

食管癌是腫瘤引起死亡的常見疾病，居世界癌癥死因順位的第6位，全球每年約有45.6萬食管癌新發(fā)病例和40萬死亡病例，而我國食管癌發(fā)病率和死亡率均較高。同時(shí)，有研究者對食管癌近20年的發(fā)展做出預(yù)測，截至2040年，世界食管癌發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)預(yù)計(jì)上升至91.33萬人，約是目前數(shù)據(jù)的1.7倍[11]。由于食管癌缺乏有效的臨床診斷方法，常在發(fā)病后期被診斷，目前手術(shù)、放療和化療是其典型治療方法，但治療效果與患者預(yù)后均不佳。

已證實(shí)miRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡作為癌基因或腫瘤抑制因子。其中，miR-503異常表達(dá)與許多疾病包括癌癥有關(guān)。miR-503通過自身序列堿基配對形式與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)形成完全或不完全互補(bǔ)，導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或者翻譯抑制，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的目的[12]。據(jù)此，推斷miR-503在食管癌中表達(dá)量的變化可能作為臨床病理表現(xiàn)一個(gè)重要標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比，miR-503在食管癌組織中高表達(dá)，與Liu等[13]的研究結(jié)果相一致。通過分析食管癌組織中miR-503相對表達(dá)量與一般臨床資料的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-503在食管癌組織中表達(dá)與浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；Wu等[14]也發(fā)現(xiàn)，與未患病食管組織比較，食管癌組織中miR-503表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢，進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)miR-503表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)。由此推測miR-503或可作為食管癌早期診斷的標(biāo)志物。

Cadherin為鈣黏附蛋白家族的成員之一，是一種細(xì)胞骨架黏蛋白[15]。E-cadherin的表達(dá)減少或丟失與腫瘤臨床病理表現(xiàn)存在一定關(guān)系，已有研究者檢測到食管癌患者的外周血標(biāo)本中也存在E-cadherin等基因的高甲基化，并證實(shí)進(jìn)行相關(guān)基因的甲基化檢測，與傳統(tǒng)的血清學(xué)標(biāo)記物相似，可用來篩選和監(jiān)測食管癌[16]。然而，E-cadherin蛋白表達(dá)對食管癌預(yù)后的影響仍存在爭議。王江陵等[17]對食管鱗癌患者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌組織中E-cadherin表達(dá)量低于癌旁組織中的表達(dá)量。本研究通過采用免疫組化法檢測食管癌患者組織中E-cadherin表達(dá)水平，結(jié)果顯示E-cadherin在食管癌組織中的陽性表達(dá)率、表達(dá)積分與癌旁正常組織相比相對較低，與上述結(jié)果相一致。本研究通過分析食管癌組織中E-cadherin表達(dá)積分與一般臨床資料的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin在食管癌組織中的表達(dá)與浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與韓少華等[18]的研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中E-cadherin的表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)的結(jié)果一致。即E-cadherin在食管癌組織中的表達(dá)可作為食管癌患者臨床生物學(xué)特性及預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)志物。

有研究報(bào)道[8]，乳腺癌細(xì)胞中miR-503-3p的上調(diào)通過直接結(jié)合其mRNA 3'非翻譯區(qū)來抑制上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-503表達(dá)與E-cadherin表達(dá)積分呈負(fù)相關(guān)，提示miR-503可能通過抑制E-cadherin的表達(dá)參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。經(jīng)Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，miR-503為高表達(dá)時(shí)，患者預(yù)后5年累計(jì)生存率較差。其中，外國研究學(xué)者Ide等[19]的研究成果也發(fā)現(xiàn)miR-503在食管癌患者中為高表達(dá)水平，其預(yù)后效果較差。E-cadherin在食管癌患者組織中為顯著低表達(dá)，與患者預(yù)后密切相關(guān)。推測食管癌組織中E-cadherin低表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞極性和組織結(jié)構(gòu)的異常改變，使細(xì)胞喪失黏附作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的解離，有利于腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，這與Li等[20]的研究結(jié)果相一致。由此得出，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的miR-503與食管癌早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后不良相關(guān)；E-cadherin也可作為評(píng)價(jià)食管鱗癌生物學(xué)特性及臨床預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)志物。

綜上所述，在食管癌組織中miR-503呈高表達(dá)，E-cadherin呈低表達(dá)，二者與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后密切相關(guān)。二者可能相互作用，共同調(diào)控食管癌的發(fā)病機(jī)制，然而，其具體機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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