陳心，杜清，尤昭玲，梁惠珍

〔摘要〕 目的 研究補(bǔ)腎助卵湯對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能下降（DOR）模型大鼠卵巢組織中胎盤生長(zhǎng)因子（PLGF）及其受體fms樣酪氨酸激酶1（Flt-1）表達(dá)水平的影響。方法 選取9只動(dòng)情周期正常的大鼠，隨機(jī)分為3組，每組3只，空白組給予蒸餾水灌胃，模型組及補(bǔ)腎助卵湯組給予雷公藤多苷片懸浮液，連續(xù)14 d進(jìn)行灌胃造模。觀察大鼠動(dòng)情周期，出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂提示造模成功?？瞻捉M給予生理鹽水;模型組給予雷公藤多苷片5 mg/（kg·d）及生理鹽水;補(bǔ)腎助卵湯組給予雷公藤多苷片5 mg/（kg·d）及補(bǔ)腎助卵湯24 g/（kg·d）。觀察大鼠性周期變化，免疫組化檢測(cè)和Western blot檢測(cè)大鼠卵巢組織PLGF和Flt-1的表達(dá)水平。結(jié)果 模型組大鼠動(dòng)情周期出現(xiàn)延長(zhǎng)、不規(guī)則甚至紊亂現(xiàn)象。補(bǔ)腎助卵湯組動(dòng)情周期正常，與空白組相比，動(dòng)情周期相對(duì)延長(zhǎng);與模型組相比，動(dòng)情周期有所恢復(fù)。3組大鼠卵巢組織中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有PLGF和Flt-1表達(dá)，與空白組相比，模型組大鼠卵巢功能下降后PLGF和Flt-1蛋白表達(dá)水平下降（P<0.05）;與模型組相比，補(bǔ)腎助卵湯組上調(diào)大鼠卵巢組織中PLGF和Flt-1蛋白表達(dá)水平（P<0.05）。結(jié)論 補(bǔ)腎助卵湯可調(diào)節(jié)雷公藤多苷所致DOR大鼠動(dòng)情周期，并對(duì)卵巢功能下降大鼠卵巢組織PLGF及Flt-1水平有一定的改善效果。

〔關(guān)鍵詞〕 卵巢功能低下;補(bǔ)腎助卵湯;胎盤生長(zhǎng)因子;fms樣酪氨酸激酶1

〔中圖分類號(hào)〕R271.9? ? ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.007

Bushen Zhuluan Decoction Up-regulates the Levels of PLGF and Flt-1 in the Ovaries of Rats with Low Ovarian Function Induced by Tripterygium Wilfordii Polyglycosides

CHEN Xin1， DU Qing1， YOU Zhaoling2， LIANG Huizhen3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

3. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Bushen Zhuluan Decoction on the expression of placenta growth factor （PLGF） and its receptor fms-like tyrosine kinase l （Flt-1） in the ovarian tissue of diminished ovarian reserve （DOR） model rats. Methods 9 animals with normal estrus cycle were selected and randomly divided into 3 groups， with 3 animals in each group. The blank group was given distilled water gavage， and the model group and the Bushen Zhuluan Decoction group were given tripterygium wilfordii polyglycoside suspension for 14 consecutive days to establish model. The estrous cycle of rats was observed， the appearance of estrous cycle disorder indicated that the model was successful. The blank group was given normal saline; the model group was given tripterygium wilfordii polyglycoside tablets 5 mg/（kg·d） and normal saline; the Bushen Zhuluan Decoction group was given tripterygium wilfordii polyglycosides tablets 5 mg/（kg·d） and Bushen Zhuluan Decoction 24 g/（kg·d）. The changes of rat sex cycle was observed. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression levels of PLGF and Flt-1 in rat ovarian tissue. Results The estrus cycle of rats in the model group was prolonged， irregular and even disordered. The estrus cycle of the Bushen Zhuluan Decoction group was normal， the estrus cycle was relatively prolonged than blank group; compared with the model group， the estrus cycle was restored. The nucleus and cytoplasm of the three groups of rat ovarian tissues both PLGF and Flt-1 were expressed. Compared with the blank group， the expression of PLGF and Flt-1 protein in the model group decreased significantly after the ovarian function decreased （P<0.05）; compared with the model group， Bushen Zhuluan Decoction group significantly up-regulated the expression levels of PLGF and Flt-1 protein in the ovarian tissue of rats （P<0.05）. Conclusion Bushen Zhuluan Decoction can regulate estrous cycle of DOR rats induced by tripterygium glycosides， and improve the levels of PLGF and Flt-1 in ovarian tissues of rats with reduced ovarian function.

〔Keywords〕 decreased ovarian function; Bushen Zhuluan Decoction; placenta growth factor; fms-like tyrosine kinase l

卵巢儲(chǔ)備功能下降（diminished ovarian reserve， DOR）是影響女性生殖系統(tǒng)健康的一類婦科常見疾病，是指卵泡數(shù)目減少且質(zhì)量降低，促使女性出現(xiàn)內(nèi)分泌紊亂、月經(jīng)失調(diào)及不孕的臨床表現(xiàn)[1]。DOR可進(jìn)展成卵巢早衰（premature ovarian failure， POF），故早期診治本病，可使卵巢儲(chǔ)備功能得到改善，提高生育能力，延緩POF的出現(xiàn)[2]。補(bǔ)腎助卵湯為尤昭玲教授補(bǔ)腎活血方加減而來，在臨床中具有補(bǔ)腎填精、活血調(diào)經(jīng)之效，能夠有效改善卵巢儲(chǔ)備功能，然而補(bǔ)腎助卵湯對(duì)DOR的治療機(jī)制尚不明確。

胎盤生長(zhǎng)因子（placenta growth factor，PLGF）作為血管內(nèi)皮因子，與其受體fms樣酪氨酸激酶1（fms-like tyrosine kinase-1， Flt-1）結(jié)合后能夠活化內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)卵巢血管生成?；诖?，本實(shí)驗(yàn)采用雷公藤建立大鼠卵巢功能下降模型，通過觀察大鼠動(dòng)情周期，并結(jié)合蛋白水平表達(dá)檢測(cè)來探究補(bǔ)腎助卵湯對(duì)大鼠卵巢功能下降的卵巢組織中PLGF及其受體Flt-1表達(dá)調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物

18只SD大鼠，雌性，7周齡，SPF級(jí)，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，晝夜節(jié)律12 h/12 h，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2? 藥物

雷公藤多苷片（批號(hào)：20200902，湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司），5 mg/mL雷公藤多苷片的配置：取1 000 mg雷公藤多苷片用研缽研碎，加入200 mL生理鹽水配置成5 mg/mL的混懸液。補(bǔ)腎助卵湯藥物組成：巴戟天10 g，肉蓯蓉10 g，覆盆子10 g，枸杞子10 g，桑椹10 g，山藥15 g，蓮子15 g，橘葉10 g，黃精10 g，黨參10 g，黃芪10 g，白術(shù)10 g，玫瑰花10 g，陳皮10 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g，三七3 g，原藥材均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房，2.4 g/mL補(bǔ)腎助卵湯的配置：將1.7 kg的生藥平均分成6份，取其中一份放入砂鍋中，加入適量水沒過中藥，浸泡30 min，然后再煎煮50 min，將藥水濾出，加入第二遍水浸沒生藥再煎煮40 min，之后將藥水濾出，將過濾好的藥水混合濃縮，終體積濃縮成708 mL。

1.3? 試劑

辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（批號(hào)：ZB-2301，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;DAB顯色試劑盒（批號(hào)：CW0125）、中性樹脂（批號(hào)：CW0136）均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;蘇木素染色（批號(hào)：AR1180-1，上海德生生物科技有限公司）;PLGF抗體（批號(hào)：10642-1-ap）、Flt-1抗體（批號(hào)：13687-1-ap）均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司;BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：CW0014S，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）;PVDF膜（批號(hào)：IPVH00010，美國(guó)Millipore公司）;封閉專用脫脂奶粉（批號(hào)：P1622，北京普利萊基因技術(shù)有限公司）;牛血清白蛋白（批號(hào)：A8020，北京索萊寶科技有限公司）;超敏發(fā)光液（批號(hào)：RJ239676，賽默飛世爾科技有限公司）。

1.4? 儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)：HGZF-101-1，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）;熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：DHP-9054，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）;顯微鏡（型號(hào)：BX43，日本Olympus公司）;全自動(dòng)酶標(biāo)儀（型號(hào)：WD-2102B）、蛋白垂直電泳儀（型號(hào)：DYY-6C）均購(gòu)自北京六一生物科技有限公司;全自動(dòng)樣品快速研磨儀（型號(hào)：Tiss-12，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）;超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：Chemi DocTM XRS+，上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

2 方法

2.1? 動(dòng)物分組

SPF級(jí)大鼠18只適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，做5 d的陰道脫落細(xì)胞學(xué)涂片。每天14∶30左右進(jìn)行陰道涂片。用生理鹽水將棉簽浸濕，再輕輕插入大鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)后取出，涂在玻片上。光鏡下觀察陰道上皮脫落細(xì)胞變化情況，觀察動(dòng)情周期變化。篩選動(dòng)情周期正常者9只大鼠作為受試動(dòng)物。隨機(jī)分為3組，空白組、模型組、補(bǔ)腎助卵湯組，每組3只。實(shí)驗(yàn)過程大鼠無死亡。

2.2? 卵巢功能下降大鼠模型制備

將動(dòng)情周期正常的動(dòng)物篩選好后，空白組給予蒸餾水灌胃，20 g/（kg·d），連續(xù)14 d，其余各組以雷公藤多苷片懸浮液5 mg/（kg·d）灌胃，連續(xù)14 d造模。從灌胃開始第4天起，進(jìn)行兩個(gè)性周期陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，觀察動(dòng)情周期，動(dòng)情周期紊亂提示卵巢功能下降大鼠模型制備成功[3-5]。

2.3? 藥物干預(yù)

按藥物與人體表面積折算給藥劑量?？瞻捉M、模型組：9∶00和16∶00均給予生理鹽水;其余組9∶00給予雷公藤多苷片5 mg/（kg·d），16∶00給予相應(yīng)藥物;補(bǔ)腎助卵湯組予補(bǔ)腎助卵湯24 g/（kg·d），連續(xù)21 d，每只大鼠所用藥物均研碎溶解于3 mL生理鹽水，或濃縮為3 mL。

2.4? 性周期變化觀察

用藥結(jié)束后連續(xù)5 d陰道涂片。將生理鹽水浸潤(rùn)的棉簽輕輕插入大鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)后取出、涂片，光鏡下觀察陰道上皮脫落細(xì)胞變化情況，觀察動(dòng)情周期變化。

2.5? 免疫組化檢測(cè)

烤片：組織切片入放入65 ℃烤箱中烤2 h;脫蠟：切片在二甲苯放置10 min，更換二甲苯再放置10 min;水化：將切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和純化水中各5 min?？乖迯?fù)：將切片放入修復(fù)盒中，加入抗原修復(fù)液（檸檬酸緩沖液），高壓鍋加熱到自動(dòng)放氣，2 min后離開熱源自然冷卻，棄去抗原修復(fù)液，將切片用PBS緩沖液淋洗。將切片移入濕盒中，加入新鮮配制的3%雙氧水，以去除內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，室溫孵育10 min，PBS緩沖液充分淋洗。封閉：PBS緩沖液浸洗玻片3次，每次5 min，吸水紙吸干組織周圍的PBS緩沖液，在玻片上滴加5%牛血清白蛋白，37 ℃封閉30 min。敷一抗：用吸水紙吸掉組織周圍的封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗：PLGF（1∶200），F(xiàn)lt-1（1∶100），放入濕盒中，4 ℃孵育過夜。敷二抗：取出4 ℃孵育過夜?jié)窈?，室溫靜置45 min，PBS緩沖液浸洗玻片3次，每次5 min，滴加辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（1∶100），37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液充分淋洗。DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS緩沖液或自來水沖洗1 min;蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化，返藍(lán);自來水沖洗1 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

2.6? Western blot檢測(cè)

將組織在低溫條件下打碎后，每孔加入100 μL的裂解液，置于冰上20 min后，于12 000 r/min（離心半徑9 cm）條件下離心10 min，去上清液即得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h，后用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min。一抗溶液孵育（1∶1 000），4 ℃過夜;二抗溶液中室溫孵育2 h。在膜上滴加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Image J”軟件分析各條帶灰度值。

2.7? 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，若資料滿足正態(tài)性和方差齊性，則采用單因素方差分析，反之則采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 補(bǔ)腎助卵湯干預(yù)對(duì)大鼠動(dòng)情性周期的影響

空白組的大鼠在5 d后就出現(xiàn)動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期，有穩(wěn)定的動(dòng)情周期。模型組則持續(xù)性在動(dòng)情前期和動(dòng)情間期，出現(xiàn)動(dòng)情周期延長(zhǎng)、不規(guī)則甚至紊亂。與模型組相比，補(bǔ)腎助卵湯組動(dòng)情周期正常，動(dòng)情周期在10 d后按照動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期循環(huán)，出現(xiàn)動(dòng)情周期相對(duì)延長(zhǎng)。見圖1、表1。

3.2? 大鼠卵巢組織中PLGF和Flt-1的表達(dá)情況

免疫組化檢測(cè)及Western blot檢測(cè)出PLGF和Flt-1在3組大鼠卵巢組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá)，與空白組相比，模型組大鼠PLGF和Flt-1蛋白表達(dá)水平下降（P<0.05）;與模型組相比，補(bǔ)腎助卵湯組大鼠卵巢組織中PLGF和Flt-1蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P<0.05）。見圖2、表2-3。

4 討論

DOR目前尚無較好的方法進(jìn)行根治，西醫(yī)主要通過激素治療、免疫治療、生育治療等對(duì)癥支持治療來控制本病進(jìn)展，但激素類藥物不良反應(yīng)大，復(fù)發(fā)率高，患者心理難以承受[6]。中醫(yī)學(xué)并無記載DOR這一病名，但根據(jù)患者臨床表現(xiàn)和體征，可歸類于月經(jīng)病中“月經(jīng)后期”及“血枯經(jīng)閉”。《傅青主女科·調(diào)經(jīng)》云：“經(jīng)本于腎……經(jīng)水出諸腎”，腎藏精，主生殖，腎主宰女性一生的生殖機(jī)能的發(fā)育、旺盛和衰退，因此腎對(duì)女性卵巢生理功能的實(shí)現(xiàn)起著關(guān)鍵性作用[7]。研究[8]認(rèn)為腎氣不足，腎精耗損是本病發(fā)病基礎(chǔ)，婦人以血為基本，氣血虧虛，氣虛血瘀是本病發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。有學(xué)者[9]提出腎虛血瘀是DOR最主要的病因病機(jī)，故常以補(bǔ)腎活血作為治療原則。實(shí)驗(yàn)研究[10]已明確證實(shí)補(bǔ)腎活血中藥可以調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸。本研究所用補(bǔ)腎助卵湯由巴戟天、肉蓯蓉、黃芪、覆盆子、山藥、黃精、陳皮、枸杞子、桑椹、當(dāng)歸、蓮子、橘葉、黨參、白術(shù)、玫瑰花、川芎、三七等中藥配伍組成，共湊補(bǔ)腎填精、活血調(diào)經(jīng)之功效。方中黃精、桑椹、枸杞子可填補(bǔ)腎精、滋補(bǔ)肝腎;巴戟天、肉蓯蓉、覆盆子溫補(bǔ)腎陽(yáng)，臨床常聯(lián)合使用補(bǔ)腎陰、補(bǔ)腎陽(yáng)藥物，共同調(diào)補(bǔ)腎中陰陽(yáng);黨參、山藥、陳皮、黃芪、白術(shù)相配，共湊益氣健脾、滋補(bǔ)脾腎之功;川芎、當(dāng)歸、三七有活血行氣調(diào)經(jīng)之效;橘葉、玫瑰花能夠疏肝理氣、調(diào)暢氣機(jī)?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉可通過調(diào)節(jié)大鼠性激素水平，提高Bcl-2/Bax凋亡蛋白表達(dá)，抑制TNF-α和IFN-γ的表達(dá)，從而減少卵泡閉鎖以及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減慢卵巢衰竭速度[11];黃芪運(yùn)用于雷公藤多苷POF大鼠可發(fā)揮減毒效應(yīng)，且能降低凋亡分子表達(dá)[12];覆盆子、枸杞子具有調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸功能，有助于改善女性生殖系統(tǒng)功能，并能促進(jìn)黃體功能，增加子宮內(nèi)膜血流，調(diào)節(jié)卵巢性激素的作用[13-14];當(dāng)歸、玫瑰花具有抗氧化功能，從而減輕圍絕經(jīng)期綜合征大鼠的氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮延緩生殖器官功能衰退的作用[15]。

本研究所采用的雷公藤是一種皮部具有很大毒性的中藥，其能嚴(yán)重影響生殖功能[16]，汪倩等[17]使用雷公藤對(duì)大鼠進(jìn)行14 d造模灌胃以后，大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂、動(dòng)情周期持續(xù)延長(zhǎng)，卵巢內(nèi)成熟卵泡減少，閉鎖卵泡增多，黃體體積減小，且卵巢內(nèi)部出現(xiàn)瘢痕樣組織。研究[18]發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷可降低小鼠生育能力，下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothe？鄄

lial growth factor， VEGF）、上調(diào)內(nèi)皮抑制素（endostatin， ES）的表達(dá)，減少卵巢血管生成，進(jìn)而影響卵泡生長(zhǎng)，進(jìn)一步說明其生殖毒性可能是通過直接損傷卵巢組織結(jié)構(gòu)，并認(rèn)為采用雷公藤多苷造模DOR大鼠符合中醫(yī)腎虛血瘀證型。因此，由雷公藤建立的DOR大鼠模型有利于從中醫(yī)角度病證結(jié)合研究補(bǔ)腎助卵湯對(duì)卵巢功能低下模型的影響。

卵巢血管可以為卵泡生長(zhǎng)提供循環(huán)支持，并影響著卵巢儲(chǔ)備功能[19]。PLGF作為VEGF家族中的一員，是一種分泌型同源二聚體糖蛋白，包括PLGF 1-4 4種異構(gòu)體，可通過與Flt-1特異性結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)作用。PLGF參與內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、存活、血管形成、缺血組織血管再通以及及胎盤絨毛膜血管形成[20]。已有研究[21-22]證實(shí)PLGF與其受體Flt-1結(jié)合后能夠促使血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，促進(jìn)新生血管形成。尹燕等[23]發(fā)現(xiàn)運(yùn)用補(bǔ)腎益氣和血方能促進(jìn)DOR大鼠VEGF及其受體Flt-1、kdr蛋白的表達(dá)，不僅促進(jìn)卵巢新生血管重建和生成，并可以保護(hù)和修復(fù)損傷的卵巢組織血管。吳笛等[24]發(fā)現(xiàn)通過左歸丸干預(yù)雷公藤多苷造模DOR大鼠后，PLGF和Flt-1蛋白表達(dá)水平上調(diào)，促進(jìn)卵巢血管生成。本研究所建立大鼠DOR模型是通過比較治療前后大鼠卵巢功能是否得到改善，本文研究結(jié)果顯示，PLGF和Flt-1受體蛋白在3組大鼠卵巢組織中均有不同程度表達(dá)，DOR模型組中PLGF和Flt-1蛋白表達(dá)水平低于空白組（P<0.05），其下降會(huì)減少卵巢血供從而導(dǎo)致卵巢功能下降。而通過補(bǔ)腎助卵湯灌胃DOR大鼠模型后，大鼠動(dòng)情周期基本恢復(fù)正常，且提高了大鼠卵巢組織中PLGF和Flt-1蛋白表達(dá)水平（P<0.05），從而促進(jìn)卵巢血管生成，使卵巢功能得到改善。

綜上所述，使用補(bǔ)腎助卵湯對(duì)雷公藤多苷所致DOR模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，可調(diào)節(jié)大鼠動(dòng)情周期，改善大鼠卵巢功能，促進(jìn)卵巢血管生成，其作用機(jī)制可能是補(bǔ)腎助卵湯能夠調(diào)控PLGF及其特異性受體Flt-1蛋白表達(dá)，從而起到保護(hù)卵巢功能的作用，可作為DOR是否得到改善的重要指標(biāo)。

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（本文編輯? 賀慧娥 黎志清）