黃帆， 吳存書(shū)， 張水冰， 趙思怡， 范志勇， 吳山

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405）

椎間盤退變（intervertebral degeneration disc，IVDD）是一個(gè)因生物力學(xué)的磨損或者肌體細(xì)胞代謝導(dǎo)致機(jī)體衰老而引起的椎間盤組織的力學(xué)和結(jié)構(gòu)特性改變的復(fù)雜病變過(guò)程[1-2]，椎間盤退變是腰椎間盤突出癥的根本病理變化。腰椎間盤突出癥好發(fā)于青壯年，其主要的臨床表現(xiàn)如腰痛、坐骨神經(jīng)痛、馬尾綜合征等對(duì)患者的勞動(dòng)能力、生活質(zhì)量可產(chǎn)生嚴(yán)重影響。腰椎間盤突出癥的發(fā)病人群與癥狀特點(diǎn)、治療、相關(guān)醫(yī)療費(fèi)用等已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[3-6]。

中醫(yī)將腰椎間盤突出癥歸屬為“腰痛”“痙證”“痹證”等范疇，認(rèn)為其基本病機(jī)為“氣虛血瘀，本虛標(biāo)實(shí)”[7]。根據(jù)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[8]，腰椎間盤突出癥被分為血瘀證、寒濕證、濕熱證、肝腎虧虛證4 種。椎間盤屬于中醫(yī)“筋骨”的范疇，中醫(yī)對(duì)于椎間盤退變引起的疾病多從“筋骨并重”的角度進(jìn)行論治[9-10]，臨床常用治療方法為益氣化瘀、補(bǔ)益肝腎等[11]。中醫(yī)藥治療腰椎間盤退變有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[12-14]，但是目前有關(guān)中醫(yī)藥治療腰椎間盤突出癥的研究以臨床觀察為主，樣本量較少，缺乏多中心大樣本的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究[15-16]。為深入研究中醫(yī)藥治療腰椎間盤突出癥的療效機(jī)制，亟需構(gòu)建病證結(jié)合且符合“筋骨并重”理論的腰椎間盤退變的動(dòng)物模型，探討疾病與中醫(yī)證候相關(guān)聯(lián)的造模方法，以及哪些干預(yù)因素會(huì)影響病證結(jié)合模型的構(gòu)建等問(wèn)題[17]。以下對(duì)近年來(lái)的腰椎間盤退變動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并探討建立有效的“筋骨并重”動(dòng)物模型。

1 腰椎間盤退變動(dòng)物模型研究進(jìn)展

1.1 機(jī)械損傷模型是指致傷物與被致傷物接觸，通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)作用造成機(jī)體正常組織的破壞或器官的機(jī)能性障礙，從而建立所需的損傷模型。

1.1.1 纖維環(huán)損傷模型 纖維損傷大鼠模型由Zhang H 等[18]提出，具體操作如下：在無(wú)菌環(huán)境中通過(guò)吸入麻醉劑異氟醚來(lái)誘導(dǎo)和維持大鼠麻醉，觸診后確定椎間盤的水平，在熒光鏡下透視定位，確?？梢暬橆^穿透和穿刺針針刺通過(guò)髓核插入背側(cè)環(huán)，部分穿過(guò)腹側(cè)環(huán)；控制進(jìn)針深度約為皮下5 mm，隨后慢慢將穿刺針旋轉(zhuǎn)180°，保持5 s 后取出，在術(shù)后4、8、12 周隨機(jī)抽取大鼠進(jìn)行相關(guān)影像學(xué)和組織學(xué)檢查。該方法可建立一種新穎、簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷性較小的椎間盤退化動(dòng)物模型。通過(guò)將針頭插入大鼠尾椎椎間盤，可誘發(fā)椎間盤退變，而不會(huì)刺激周圍的組成組織[19]。纖維損傷大鼠模型優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便易行，與人類腰椎間盤退變具有相同的生化改變，但缺乏對(duì)重力因素的考慮，無(wú)法完全模擬人類腰椎間盤緩慢退變的過(guò)程。

1.1.2 終板損傷模型 Yuan W等[20]將大鼠用體積分?jǐn)?shù)為5%鹽酸氯胺酮（40 mg/kg）加0.5%地西泮片（2 mg/kg）腹腔注射麻醉，在X 射線熒光透視指引下，于距第7 與第8 腰椎（L7/L8）的椎間盤交界處3 mm 的L8 椎體上，用連接到血管的1 mL 注射器向其椎體骨髓中注入30 μL無(wú)水乙醇。將腰穿刺針?lè)胖? min以使酒精充分?jǐn)U散，然后將其取出。運(yùn)用這種方法造模，術(shù)后4周即可明顯觀察到椎間盤退變，與針刺法相比，退變過(guò)程所需時(shí)間較短。而且無(wú)水乙醇注射不會(huì)直接破壞終板結(jié)構(gòu)，而是通過(guò)破壞終板下方椎體的微循環(huán)而起作用，即通過(guò)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)障礙導(dǎo)致腰椎間盤變性，避免了椎體終板可能塌陷的缺點(diǎn)[21]。此方法優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)破壞代謝來(lái)制造模型，損傷更小。但此法對(duì)注射、穿孔的操作要求較高，終板受損程度難以控制，影響了該方法的可靠性、可控性、可重復(fù)性。

1.1.3 髓核損傷模型 Schwan S 等[22]通過(guò)經(jīng)皮背外側(cè)入路建立羊的髓柱損傷模型，用顯微手術(shù)鉆穿刺至椎間盤纖維環(huán)（L1/L2 和L5/L6），去除羊椎間盤中的髓核組織。術(shù)后6周，若組織學(xué)和椎間盤造影提示椎間盤結(jié)構(gòu)被破壞和椎間盤高度降低則說(shuō)明造模成功。此法優(yōu)點(diǎn)在于創(chuàng)傷小，可保護(hù)脊柱其他組織不被破壞，但該方法主要適用于大型動(dòng)物，缺乏髓核緩慢病變過(guò)程。

1.2 應(yīng)力改變模型關(guān)于應(yīng)力改變模型，Hirata H等[23]通過(guò)在大鼠的第8至第10尾椎上安裝一個(gè)體外彈簧壓縮裝置，從遠(yuǎn)端對(duì)椎間盤施加額外的軸向力以產(chǎn)生壓縮應(yīng)力。加載56 d 后發(fā)現(xiàn)大鼠椎間盤內(nèi)細(xì)胞凋亡數(shù)目增多，椎間盤高度顯著降低，退行性變更加嚴(yán)重。在腰椎間盤退變模型的構(gòu)建中，應(yīng)力改變模型被認(rèn)為是最接近實(shí)際的椎間盤退行性變的病理機(jī)制。但實(shí)驗(yàn)中的體外彈簧具有無(wú)法施加多種維度力的局限性，并且由于不能使應(yīng)力作用及椎間盤退行性變程度標(biāo)準(zhǔn)化，致使其在模型應(yīng)用中受到了限制[24]。

1.3 敲除特定基因模型Millecamps M 等[25]在研究中使用一種轉(zhuǎn)基因SPARC 小鼠品系進(jìn)行了腰背部疼痛的行為學(xué)測(cè)量，結(jié)果顯示老齡SPARC 突變鼠出現(xiàn)抓握力障礙、對(duì)軸向拉伸的耐性低、后背皮膚對(duì)寒冷過(guò)敏以及運(yùn)動(dòng)活力下降等表現(xiàn)，且隨著年齡的增長(zhǎng)，小鼠的椎間盤退變的程度逐漸加重。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，最新研究發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞衰老和基因組不穩(wěn)定為椎間盤退變的重要驅(qū)動(dòng)力，基因敲除動(dòng)物模型為椎間盤退變的潛在機(jī)制的研究提供了重要價(jià)值[26-27]。敲除特定基因模型構(gòu)建腰椎間盤突出癥的大鼠模型方法無(wú)手術(shù)創(chuàng)傷，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物形成了一定保護(hù)，但形成的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是否能完全模擬腰椎間盤突出癥的病因、病程、病理癥狀等，仍缺乏確切的證據(jù)支持。

1.4 自發(fā)性椎間盤退變模型沙鼠具有與年齡有關(guān)的自發(fā)性腰椎間盤退變，在20世紀(jì)80年代的科學(xué)文獻(xiàn)中被引起關(guān)注。沙鼠自發(fā)性腰椎間盤退變作為一種經(jīng)典的自發(fā)性椎間盤退變模型，具有重要的研究?jī)r(jià)值[28]。Gruber H E等[29]對(duì)2～12個(gè)月大的沙鼠進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)脊柱的放射學(xué)和組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)沙鼠和人的腰椎退行性變具有許多共同的特征，包括椎間盤間隙變窄、楔形變、軟骨終板鈣化，以及椎間盤邊緣不規(guī)則和細(xì)胞凋亡等，這也是老年人椎間盤退變最為常見(jiàn)的過(guò)程。沙鼠為自發(fā)性椎間盤退變提供了模型支持，但由于沙鼠模型細(xì)胞外基質(zhì)缺乏特異性抗體表達(dá)特性，其病變機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.5 其他模型有學(xué)者通過(guò)建立細(xì)胞模型來(lái)探索椎間盤退變的機(jī)制。張坤木等[30]通過(guò)對(duì)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞的培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的演變，以期為椎間盤纖維環(huán)的分子生物組織工程研究提供方法，建立體外培養(yǎng)的大鼠椎間盤成纖維細(xì)胞模型。通過(guò)組織工程得到的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵话憧梢愿玫匕l(fā)揮細(xì)胞生物功能從而得到滿意的研究結(jié)果，但是體外培養(yǎng)的椎間盤細(xì)胞存在分化的趨勢(shì)，體外培養(yǎng)細(xì)胞具有經(jīng)過(guò)多次傳代以后可能存在軟骨細(xì)胞的表型改變等缺點(diǎn)[31]。此外，馮帥華等[32]通過(guò)采用去卵巢方法建立女性絕經(jīng)后腰椎間盤退變的動(dòng)物模型。這種模型方法的建立為臨床進(jìn)一步研究絕經(jīng)后婦女腰椎間盤退變提供了初步的動(dòng)物模型，但是去卵巢建立椎間盤退變動(dòng)物模型的研究仍任重道遠(yuǎn)。

2 基于筋骨并重理論探討腰椎間盤退變動(dòng)物模型的構(gòu)建

2.1 筋骨并重理論溯源筋骨并重是中醫(yī)傳統(tǒng)思想之一。在隋代巢元方的《諸病源候論》中有“筋骨同治，筋骨并重”理念的記載?！肮恰本哂兄С中误w，保護(hù)內(nèi)臟的作用?！端貑?wèn)·痿論》提出“宗筋主束骨而利關(guān)節(jié)也”，可見(jiàn)“筋”具有連接并約束關(guān)節(jié)、利關(guān)節(jié)而主持運(yùn)動(dòng)的作用。筋為骨提供了連接與動(dòng)力，骨為筋提供了附著點(diǎn)和著力點(diǎn)[33]。筋骨相互協(xié)作，共同維持機(jī)體的動(dòng)態(tài)平衡，筋骨失衡則會(huì)引起包括腰椎間盤退變?cè)趦?nèi)的各種骨功能疾病。

中醫(yī)認(rèn)為筋骨之間的相互依存根源在于“肝腎同源”[34]。骨的生長(zhǎng)發(fā)育以及修復(fù)都有賴于腎之精氣的濡養(yǎng)，故腎精足則骨強(qiáng)有力，腎精虧則骨萎軟。肝藏血，血養(yǎng)筋，故肝強(qiáng)則筋舒有力，肝虛則筋氣不舒，活動(dòng)遲鈍。根據(jù)中醫(yī)肝腎同源的原理，肝藏血，血化精以充養(yǎng)筋骨。年齡增長(zhǎng)、房事不節(jié)、久病失養(yǎng)、積勞成疾等因素均可致肝腎虧虛，精血生化不足，筋骨失養(yǎng)，從而導(dǎo)致腰椎間盤退變等各種退行性骨病。

2.2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)筋骨并重理論的認(rèn)識(shí)中醫(yī)學(xué)中骨的觀念與現(xiàn)代解剖學(xué)基本一致，中醫(yī)學(xué)中筋的概念則較為寬泛，主要是指具有一定力學(xué)性能的纖維組織，其外延涉及肌肉、肌束、肌原纖維、肌絲、肌小節(jié)和韌帶、關(guān)節(jié)囊等組織中具有生物力學(xué)性能的纖維結(jié)構(gòu)[35]。一些臨床研究表明周圍的肌肉力量下降，可導(dǎo)致腰椎不穩(wěn)定和低位背部疼痛，而核心穩(wěn)定性練習(xí)會(huì)增強(qiáng)腰椎的穩(wěn)定性[36]，該研究結(jié)果符合中醫(yī)“屈伸行動(dòng)，皆筋為之”的認(rèn)識(shí)。同時(shí)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，腎臟通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化因子，如骨保護(hù)素（OPG）和核因子κB-配體的受體激活劑（RANKL）來(lái)控制骨骼[37]，強(qiáng)肝舒筋的煎劑可以通過(guò)腫瘤壞死因子（TNF）-α/核因子（NF）-κB途徑抑制椎間盤退變[38]，這與中醫(yī)肝腎同源、筋骨并重的理念相吻合。McPherron A C[39]等通過(guò)敲除特定基因模型對(duì)腰椎間盤退變的機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果顯示肌肉量和骨量與腰椎間盤退變有著密切的關(guān)系?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，對(duì)椎間盤退變動(dòng)物模型給予補(bǔ)肝腎的方劑治療后，可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、抑制炎性因子的表達(dá)、保護(hù)細(xì)胞外機(jī)制等途徑來(lái)延緩椎間盤退變[40-42]?？梢?jiàn)腰椎間盤退變與肝腎有著密切關(guān)系。筋骨并重結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療方法已在治療椎間盤退變的臨床實(shí)踐中取得良好的效果[43-45]。結(jié)合補(bǔ)肝腎復(fù)方治療腰椎間盤退變引起的腰椎間盤突出癥取得了很好的療效[46-48]，此為基于“筋骨并重”理論構(gòu)建腰椎間盤退變模型提供了臨床依據(jù)。

2.3 筋骨并重理論對(duì)腰椎間盤退變動(dòng)物模型構(gòu)建的指導(dǎo)意義現(xiàn)有的腰椎間盤退變動(dòng)物模型多為單一因素造模，包括機(jī)械損傷模型、應(yīng)力改變模型、敲除特定基因模型、自發(fā)性椎間盤退變模型以及其他模型等。其中機(jī)械損傷模型是通過(guò)直接損傷纖維環(huán)、終板、髓核來(lái)進(jìn)行造模，該模型造模過(guò)程中的損傷方式較為理想化，但現(xiàn)實(shí)生活中出現(xiàn)類似損傷的概率極低，相似性較差。應(yīng)力改變模型通過(guò)給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物施加力學(xué)負(fù)荷造模，忽視了腰椎間盤退變患者自身的身體狀況的特殊性，且應(yīng)力作用大小和椎間盤退變程度缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。敲除特定基因模型可模擬增齡型腰椎間盤退變，較為適合研究腰椎間盤退變的機(jī)制，造模相似性較高，但易行性和經(jīng)濟(jì)性不足。自發(fā)性椎間盤退變模型能夠較完整地模擬腰椎間盤退變過(guò)程，但對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類的要求較高，現(xiàn)有研究證明僅沙鼠、非軟骨營(yíng)養(yǎng)不良性犬、豬、羊駝等少數(shù)動(dòng)物適宜用作建立腰椎間盤退變模型[49]?；诂F(xiàn)有單一因素造模的種種缺陷，本文提出基于“筋骨并重”理論構(gòu)建復(fù)合因素腰椎間盤退變模型。

基于“筋骨并重”理論構(gòu)建腰椎間盤退變復(fù)合因素模型能夠統(tǒng)籌考慮造成腰椎間盤退變的內(nèi)部因素與外部因素，將疾病與中醫(yī)證候相結(jié)合，符合中醫(yī)的整體觀念，與臨床病癥具有較強(qiáng)的相似性，且具有更高的可行性和經(jīng)濟(jì)性，有利于腰椎間盤退變的病理機(jī)制及藥物的干預(yù)作用等相關(guān)研究的發(fā)展。

2.4 基于“筋骨并重”理論構(gòu)建復(fù)合因素模型中醫(yī)證候動(dòng)物模型是在中醫(yī)整體觀念和辨證論治思想指導(dǎo)下運(yùn)用藏象學(xué)說(shuō)和病機(jī)理論，把人類疾病的某些特征在動(dòng)物身上模擬復(fù)制而成[50]。張銀剛等[51]通過(guò)構(gòu)建增齡型大鼠椎間盤退變模型，從同等條件下飼養(yǎng)的年齡22 個(gè)月的大鼠與年齡6 個(gè)月的大鼠的腰椎間盤取材并觀察其形態(tài)組織學(xué)改變、Ⅱ型和X 型膠原表型表達(dá)、Miyamoto 分級(jí)評(píng)分值、椎體軟骨終板血管芽數(shù)量和相對(duì)面積、軟骨終板非鈣化層/鈣化層比值等，結(jié)果顯示血管芽相對(duì)面積、X型膠原表型表達(dá)、軟骨終板非鈣化層及鈣化層比值等是評(píng)估增齡性椎間盤退變的靈敏指標(biāo)。而臨床通常采用病理學(xué)、X 線、CT、造影和MRI檢查來(lái)評(píng)價(jià)腰椎間盤退變水平[49]，常用的分級(jí)系統(tǒng)包括Pfirrmann 分級(jí)和改良的Pfirrmann 分級(jí)，該類分級(jí)方法以髓核結(jié)構(gòu)、髓核與纖維環(huán)的分界、髓核的信號(hào)強(qiáng)度、椎間盤高度等指標(biāo)進(jìn)行分級(jí)[50]。由此可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中腰椎間盤退變靈敏指標(biāo)與臨床腰椎間盤評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有所不同。故需要進(jìn)一步對(duì)腰椎間盤退變動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行探討。

椎間盤退變患者病因相對(duì)復(fù)雜，簡(jiǎn)單地通過(guò)單一的西醫(yī)病因或者危險(xiǎn)因素來(lái)解釋并預(yù)測(cè)其病程的變化發(fā)展是不夠客觀的。故認(rèn)為腰椎間盤退變動(dòng)物模型的建立應(yīng)參考中醫(yī)復(fù)合因素造模的思路，選取臨床上常見(jiàn)腰椎間盤退變?cè)蜻M(jìn)行復(fù)合造模，即構(gòu)建一個(gè)基于中醫(yī)“筋骨并重”理念的腰椎間盤退變復(fù)合因素動(dòng)物模型。采用以造成腰椎間盤退變的最主要因素作為造模依據(jù)的動(dòng)物模型為基底動(dòng)物模型，如年齡的增長(zhǎng)是引起腰椎間盤退變的最主要因素之一，即以增齡型腰椎間盤退變大鼠模型為基礎(chǔ)，具體造模方法可參考張銀鋼等[51]的增齡型椎間盤退變大鼠造模方法，并在基礎(chǔ)動(dòng)物模型上結(jié)合中醫(yī)對(duì)腰椎間盤退變“筋骨并重”“肝腎同源”的認(rèn)識(shí)構(gòu)建復(fù)合因素動(dòng)物模型。在“肝腎同源”的中醫(yī)理論指導(dǎo)下對(duì)基底動(dòng)物模型進(jìn)行慢性肝腎損傷造模，具體可參考酒精性慢性肝損傷造模法[52]和氣胸致慢性腎衰竭造模法[53]，以破壞其肝腎功能。在“筋骨并重”的中醫(yī)理論指導(dǎo)下破壞其腰椎間盤周圍的肌肉纖維組織，造成腰肌勞損，具體做法可參考方憶生等[54]的鈍挫傷型骨骼肌損傷造模法，運(yùn)用鈍器垂直打擊俯臥位大鼠第5腰椎水平腰肌，解剖和病理觀察結(jié)果證實(shí)腰肌勞損造模成功[55]。通過(guò)椎間盤退變靈敏指標(biāo)以證實(shí)造模是否成功。構(gòu)建基于“筋骨并重”中醫(yī)傳統(tǒng)理論的、符合臨床實(shí)際的腰椎間盤退變動(dòng)物模型，可更好地體現(xiàn)中醫(yī)的病因病機(jī)及其獨(dú)特的整體觀念。

綜上所述，基于“筋骨并重”理論成功構(gòu)建腰椎間盤退變復(fù)合因素實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型需同時(shí)具備以下兩個(gè)條件：首先，需要構(gòu)建一個(gè)基于常見(jiàn)致病因素所致的動(dòng)物模型，如生物力學(xué)致腰椎間盤退變、增齡型腰椎間盤退變、營(yíng)養(yǎng)不足致腰椎間盤退變、細(xì)胞凋亡致腰椎間盤退變等，可結(jié)合現(xiàn)有常見(jiàn)的機(jī)械損傷模型、應(yīng)力改變模型、敲除特定基因模型、自發(fā)性椎間盤退變模型及其他模型實(shí)現(xiàn)。其次，需要以中醫(yī)“筋骨并重”理論為指導(dǎo)，統(tǒng)籌考慮造成疾病的內(nèi)部因素和外部因素，結(jié)合多種造模方法，最大程度地還原臨床患者癥狀表現(xiàn)。除此之外，對(duì)腰椎間盤退變動(dòng)物模型的靈敏性指標(biāo)還需要進(jìn)一步深入探索。