楊珊珊，朱慧勇

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是口腔頜面部最常見的腫瘤[1]，約占口腔頜面部惡性腫瘤的50%～60%及全身惡性腫瘤的0.8%～2%，每年威脅近50萬人的生命[2]。TSCC經(jīng)常導(dǎo)致患者咀嚼、言語和吞咽功能障礙，其惡性程度較高、侵襲性強(qiáng)、極易發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3-5]。雖然近些年來腫瘤診斷技術(shù)、手術(shù)治療及放化療水平等已經(jīng)取得巨大進(jìn)步，但由于其較高的局部區(qū)域復(fù)發(fā)性和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與過去的30年相比，患者的預(yù)后并沒有得到明顯提高，TSCC的5年生存率幾乎沒有變化，這使得TSCC仍然是頭頸部最致命的腫瘤類型之一[6-8]。但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA在許多生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞的發(fā)育、增殖、凋亡、侵襲和代謝等[9-10]，它們通過沉默或者抑制癌基因表達(dá)等方式，參與到癌細(xì)胞生物程序的調(diào)控之中[11]。

1 MicroRNA的特點(diǎn)與作用機(jī)制

MicroRNA是一類僅有18～25個(gè)核苷酸的單鏈小分子RNA，廣泛存在于線蟲、果蠅、植物和包括人在內(nèi)的真核生物中，具有高度的保守性、組織特異性和時(shí)序性的非編碼RNA分子，不具有開放閱讀框(open reading frame)。MicroRNA的基因位于遺傳編碼基因的內(nèi)含子中，也有一部分存在于基因間的DNA序列中，形成成熟的MicroRNA后，發(fā)揮調(diào)控轉(zhuǎn)錄后作用。通過完全或不完全堿基互補(bǔ)配對原則與特定靶基因的mRNA的3'或5'UTR區(qū)結(jié)合，起到抑制mRNA翻譯或直接降解特定mRNA的作用[12]。據(jù)研究它們可以調(diào)節(jié)至少60%的人類基因的表達(dá)并參與其中，而且?guī)缀跛械纳镞^程都要通過它們對時(shí)間和空間的表達(dá)來調(diào)控[13]。它們的調(diào)節(jié)作用涉及到各種疾病的發(fā)病機(jī)制，包括癌癥，在這些疾病中，它們可以作為有效的致癌基因或者腫瘤抑制因子[14-15]。

2 MicroRNAs與TSCC

2.1 MicroRNAs與TSCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

成熟的MicroRNAs是由初級MicroRNA從Drosha/Dicer家族蛋白連續(xù)衍生而來的[16]。在最近的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，與正常的牙齦上皮細(xì)胞相比，TSCC細(xì)胞系UM-1中Dicer的表達(dá)較低，這表明TSCC的致癌過程干擾了MicroRNA的處理[17]。另外，在一項(xiàng)使用硝基喹啉1-氧化物(4NQO)誘導(dǎo)小鼠建立舌癌模型的研究中，發(fā)現(xiàn)包括miR-21和miR-31在內(nèi)的幾種MicroRNAs在舌上皮中顯示出了與4NQO誘導(dǎo)的上皮發(fā)病機(jī)制的相類似的反常情況[18]。同時(shí)在利用TSCC細(xì)胞系、異種移植和臨床樣本進(jìn)行的MicroRNA分析實(shí)驗(yàn)中表明，各種MicroRNA均有表達(dá)異常，提示它們可能參與了TSCC的發(fā)病機(jī)制[19]。

在眾多的MicroRNAs中，miR-21是目前已知的唯一一個(gè)在所有目前已經(jīng)研究過的實(shí)體腫瘤中均有表達(dá)的MicroRNA。miR-21定位于染色體17q23.2上的空泡膜蛋白基因的3UTR區(qū)，眾多腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)該區(qū)域表達(dá)增強(qiáng)。如在肺癌患者中，發(fā)現(xiàn)有66%的患者其miR-21的表達(dá)水平至少有2倍以上的上調(diào)。在惡性膠質(zhì)瘤患者細(xì)胞中，去除miR-21可以導(dǎo)致半胱天冬酶介導(dǎo)的程序性死亡，這兩者均可以支持其作為癌基因作用的觀點(diǎn)。在TSCC中，劉長富等[20]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)降低miR-21的表達(dá)后，可以有效地降低舌鱗癌SCC9細(xì)胞系的穩(wěn)定性，增加SCC9的凋亡。此外，有實(shí)驗(yàn)重復(fù)在瘤腔內(nèi)注射miR-21抑制劑，發(fā)現(xiàn)可顯著抑制TSCC異種移植瘤模型的腫瘤生長，它的抑制伴隨著細(xì)胞增殖和腫瘤血管生成均減少以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21-22]，意味著miR-21在TSCC的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)與PTEN(磷酸酶和緊張素同源物)和TPM1(原肌球蛋白1)的表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[23]，這是miR-21在其他癌癥類型中的兩個(gè)特征明確的靶點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了miR-21在TSCC中的潛在致癌作用。同時(shí)研究分析在舌癌旁組織及舌鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-21以及線粒體凋亡通路相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-21可能通過調(diào)節(jié)Caspase-3、Caspase-9線粒體凋亡通道來影響舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[24]。

除了具有致癌潛能的miR-21外，其他幾個(gè)如miR-125b、miR-31、miR-184、miR-24、let-7d和let-7f等在TSCC中也有著密切的聯(lián)系。新的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)miR-125b在35例TSCC患者中高表達(dá)，并與臨床分期相關(guān)，提示miR-125b表達(dá)上調(diào)可能參與TSCC的發(fā)生發(fā)展[25]。在福爾馬林固定石蠟包埋的TSCC腫瘤樣本中，可以檢測到Let-7f顯著升高。另外，與配對正常的組織相比，研究發(fā)現(xiàn)miR-184在TSCC中的表達(dá)上調(diào)。miR-184抑制劑通過靶向c-Myc[26]抑制TSCC細(xì)胞株CAL27、HN21B和HN96細(xì)胞的增殖速率，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.2 MicroRNA可能成為TSCC診斷和預(yù)后的標(biāo)志物

在各種腫瘤類型中均可觀察到MicrorRNA表達(dá)失調(diào)，這使它們成為公認(rèn)的診斷和預(yù)后標(biāo)志物以及潛在的治療靶點(diǎn)。在一項(xiàng)MicroRNA分析研究中，假設(shè)MicroRNA的表達(dá)模式在頭頸部區(qū)域具有位點(diǎn)特異性，并對扁桃體、舌根和鼻咽部的腫瘤進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個(gè)腫瘤在原發(fā)部位和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間都保持著其特有的MicroRNA表達(dá)特征[27]。鑒于目前近10%的頭頸部轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌的來源不明，利用腫瘤特異性MicroRNA可能會對包括TSCC在內(nèi)的頭頸部腫瘤作出正確的臨床診斷提供臨床意義。

在最近的一項(xiàng)研究中，TSCC中的一種致癌MicroRNA——miR-424，已被證明在相比起源于牙齦或者口底的腫瘤，優(yōu)先在TSCC組織中過表達(dá)。其在臨床正常舌組織中的表達(dá)也低于腫瘤舌組織，提示miR-424是舌腫瘤癌變的標(biāo)志物[28]。miR-21、miR-125b和miR-203也被證實(shí)在舌部、牙齦部和口底伴舌部腫瘤中有差異表達(dá)，每種腫瘤亞型之間存在相應(yīng)的差異[29]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miR-21在舌鱗癌組織中高表達(dá)，過表達(dá)miR-21有效促進(jìn)了Tca8113細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，從而提示miR-21在舌鱗癌診斷和治療可能具有一定的新型靶點(diǎn)價(jià)值[30]。此外,評估11個(gè)MircroRNA的表達(dá)，這些之前已經(jīng)被證明在頭頸樣本中有差異表達(dá)，表明miR-21和miR-375在口腔細(xì)胞學(xué)中可以有效區(qū)分TSCC患者和健康對照組的敏感性為100%，特異性為64%[31]。

此外，不同的實(shí)驗(yàn)研究中也證實(shí)了血漿、口腔細(xì)胞學(xué)以及唾液中的MicroRNA的診斷能力。在小鼠舌癌模型的組織癌變過程中，同步增加miR-21和miR-31的水平，在唾液和血漿樣本中均可明顯檢測到miR-21、miR-31和miR-146a水平的升高，表明在體液中MicroRNA重建與腫瘤組織有關(guān)[18]。在另一項(xiàng)研究中，課題組對TSCC患者和健康對照者唾液樣本中MicroRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MicroRNA中的miR-139-5p在TSCC患者唾液樣本中的表達(dá)顯著降低，而術(shù)后其在唾液中的表達(dá)水平又恢復(fù)到正常，從而提示miR-139-5p是可以作為舌癌的一種強(qiáng)診斷性的生物標(biāo)志物[32]。除此之外，我們還在早期舌癌患者的血漿中發(fā)現(xiàn)miR-184的表達(dá)水平也有自術(shù)前明顯升高到術(shù)后降低至正常水平的明顯變化，提示miR-184也可能是TSCC中一個(gè)有用的診斷生物標(biāo)志物[26]。這些發(fā)現(xiàn)都對舌癌的早期微創(chuàng)檢測和診斷非常有價(jià)值。

除了作為診斷標(biāo)記的潛力，MicroRNA也被認(rèn)為是TSCC中最強(qiáng)有力的預(yù)后評估候選之一。年輕患者侵襲性TSCC中發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的let-7家族MicroRNAs表達(dá)模式。在同一研究中，除了let-7家族MicroRNAs外，miR-130a-3p、miR-361-5p、miR-99a-5p和miR-29c-3p在侵襲性腫瘤中的表達(dá)水平均高于非侵襲性腫瘤樣本[33]。癌原性miR-21的表達(dá)及低水平的miR-195[34]已被發(fā)現(xiàn)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子，提示在TSCC中生存不良。miR-26b、miR-375表達(dá)的降低也與舌鱗癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存預(yù)后顯著相關(guān)。原發(fā)性腫瘤中miR-26表達(dá)降低的TSCC患者的平均5年生存率為26.7%，明顯低于miR-26b表達(dá)升高的患者。miR-375在腫瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤大小及患者死亡率呈正相關(guān)[35]。除這些外，miR-15b[36]、miR-26a[37]、miR-200b[36]、miR-320a[38]、miR-483[39]、miR-639[40]也均被證明與患者的各種臨床和病理特征存在顯著相關(guān)性。

2.3 與TSCC轉(zhuǎn)移相關(guān)的MicroRNA

MicroRNA除了具有致癌和抑癌的特性外，對腫瘤的遷移和侵襲有明確的細(xì)胞影響，一些MicroRNA被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移途徑中的重要效應(yīng)因子。

Dicer，編碼一種MicroRNA的處理酶，已被證明在舌鱗癌中水平下調(diào)。其下調(diào)增強(qiáng)了人TSCC細(xì)胞的相對遷移和侵襲能力，提示MicroRNA可能參與舌癌的轉(zhuǎn)移[17]。體外探究miR-23b在口腔癌轉(zhuǎn)移中的作用，利用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)(qRT-PCR)檢測了miR-23b在口腔正常細(xì)胞和口腔癌細(xì)胞中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示miR-23b在口腔癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于口腔正常細(xì)胞中的表達(dá),且隨著口腔癌轉(zhuǎn)移程度的增加而增高，在此基礎(chǔ)上,通過給細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-23b mimics的方法過表達(dá)miR-23b，發(fā)現(xiàn)增加口腔原位癌細(xì)胞Um-2中miR-23b的表達(dá)后，該細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)，表明miR-23b在口腔癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，可能成為臨床口腔癌的治療靶點(diǎn)和口腔癌檢測標(biāo)志物[41]。

在最近的一項(xiàng)研究中，將腫瘤芽殖細(xì)胞的MicroRNA圖譜與成對的中央腫瘤樣本進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)一種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的MicroRNA模式。其中，miR-320a的表達(dá)下降最為明顯，其體外抑制作用促進(jìn)了TSCC細(xì)胞系的遷移和侵襲，說明腫瘤的轉(zhuǎn)移與miR-320a表達(dá)降低以及患者生存不良存在相關(guān)[38]。TGFb(轉(zhuǎn)化生長因子)誘導(dǎo)TSCC細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，導(dǎo)致細(xì)胞的MicroRNA譜發(fā)生顯著差異。miR-639是TGFb處理細(xì)胞中最嚴(yán)重下調(diào)的MicroRNA之一，在TSCC中被發(fā)現(xiàn)通過靶向FOXC1(Forkhead box C1)誘導(dǎo)EMT，說明miR-639的表達(dá)降低與轉(zhuǎn)移和患者生存明顯相關(guān)[40]。此外，在TSCC標(biāo)本中最常見的過表達(dá)MicroRNA是miR-21，它與腫瘤的侵襲模式也密切相關(guān)。DKK2(Dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 2)是一種參與腫瘤侵襲的拮抗劑，而抑制miR-21可通過上調(diào)DKK2導(dǎo)致SCC25細(xì)胞侵襲性特征的減弱，這些發(fā)現(xiàn)提示miR-21通過靶向Wnt/β-catenin通路增強(qiáng)TSCC腫瘤侵襲能力[42]。但是由于MicroRNA是相互結(jié)合而不是單獨(dú)工作，我們還需要更全面了解MicroRNA在TSCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用特征。

2.4 MicroRNA在TSCC耐藥和治療中的作用

我們研究了解各種MicroRNA在舌癌中的作用機(jī)制，在特定的組織類型中找到它們的真正目標(biāo)，并確定精準(zhǔn)的表達(dá)模式，為開發(fā)找到更有效治療的方法。新的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)人舌鱗癌耐藥細(xì)胞株OSC-19/CDDP具有多重耐藥的生物學(xué)特性，可作為舌鱗癌的順鉑耐藥機(jī)制及多藥耐藥機(jī)制研究的理想細(xì)胞模型。顯著差異表達(dá)的MicroRNA可能在舌鱗癌耐藥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[43]。到目前為止，有幾種MicroRNA已被認(rèn)為是TSCC的潛在治療靶點(diǎn)。

在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤標(biāo)本中，Dicer的低表達(dá)與基于5-氟尿嘧啶的放化療耐藥性有關(guān)，這表明MicroRNA可能參與調(diào)控TSCC細(xì)胞的化療耐藥性[44]。研究發(fā)現(xiàn)沉默miR-21的表達(dá)可以通過靶向PDCD4(程序性細(xì)胞死亡4)誘導(dǎo)TSCC細(xì)胞對順鉑的敏感性。miR-23a的表達(dá)增加可以通過JNK依賴機(jī)制觸發(fā)Twist的表達(dá)，誘導(dǎo)TSCC細(xì)胞化療耐藥性，降低順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。另一個(gè)靶向MicroRNA——miR-181a的降低伴隨著Twist1水平的升高、EMT的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)移潛能的增強(qiáng)，從而在順鉑誘導(dǎo)的TSCC細(xì)胞化療耐藥性中發(fā)揮作用[45]。順鉑誘導(dǎo)的TSCC細(xì)胞凋亡已被證明是由線粒體分裂途徑啟動的。在這一過程中，miR-483-5p表達(dá)降低導(dǎo)致其靶基因FIS1表達(dá)升高，F(xiàn)IS1可以調(diào)節(jié)線粒體分裂和順鉑敏感性[39]。在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，BRCA1/miR-593-5p/MFF軸也被解除。順鉑治療后BRCA1 (Breast Cancer 1)表達(dá)降低，使miR-593-5p轉(zhuǎn)活化，通過降低miR-593-5p的表達(dá)，增加MFF(線粒體分裂因子)的表達(dá)，導(dǎo)致體內(nèi)外線粒體分裂，MFF是miR-593-5p的直接靶點(diǎn)，由此說明，BRCA1、MiR-593-5p、MFF軸與TSCC耐藥及患者生存顯著相關(guān)[46]。

除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)順鉑化療耐藥和敏感的舌鱗癌細(xì)胞中存在差異表達(dá)的線粒體微小RNA(MitomiRs)，特異高表達(dá)的MitomiRs：miR-1268a、miR-2392、miR-4462、miR1-290、miR-4449可能在舌鱗癌化療耐藥中具有重要作用[47]。這些發(fā)現(xiàn)表明，MicroRNAs在TSCC細(xì)胞的化療耐藥和化療藥物的使用中發(fā)揮重要作用，特別是某些靶向MicroRNA的治療藥物，比如說下調(diào)MicroRNA-17可增強(qiáng)奧沙利鉑對口腔癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用，從而為口腔癌的治療提供新思路[48]。

3 結(jié)束語

TSCC的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，病因至今尚未完全闡明，TSCC患者的5年生存率也沒有明顯改善。探討研究TSCC的發(fā)病機(jī)制，揭開它神秘的面紗，從而尋找更有效的治療方法，研制更精準(zhǔn)的靶向藥物，提高TSCC患者的生存率仍是臨床上研究的重點(diǎn)。在過去的十年中，無論是作為遺傳調(diào)控因子還是表觀遺傳調(diào)控因子，MicroRNA在包括TSCC在內(nèi)的多種癌癥中都扮演著重要的角色。但是具體的作用機(jī)制并不明確，在TSCC中它們可能是獨(dú)行俠，也可能同時(shí)調(diào)控了多個(gè)基因通路，還需要更多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究去探索各種MicroRNA在TSCC發(fā)病的起始、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和復(fù)發(fā)的潛在分子機(jī)制的作用過程，從而為TSCC的早診斷、早治療提供更廣闊的思路，為癌癥患者帶去新的希望。