陳亞華，陳慧

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563000)

急性心肌梗死已經(jīng)成為全世界心血管疾病的主要死亡原因之一，每年約1 800萬(wàn)人死于心血管疾病[1]。溶栓抗凝、手術(shù)治療等均是恢復(fù)血流的有效方法，但血流氧供恢復(fù)后，再灌注帶來(lái)的心功能不全、心力衰竭等心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)引起人們的廣泛關(guān)注[2]。而線粒體自噬是MIRI中最重要的病理生理機(jī)制之一。線粒體是雙膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，約占心肌細(xì)胞體積的30%，主要通過(guò)氧化磷酸化合成ATP，為心肌細(xì)胞的持續(xù)運(yùn)行提供能量[3]。在缺血再灌注過(guò)程中，線粒體是心肌細(xì)胞損傷和心肌細(xì)胞死亡的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)，也是主要的受損靶點(diǎn)[4]。受損后的線粒體通過(guò)釋放大量活性氧類(reactive oxygen species，ROS)、促凋亡蛋白以及開(kāi)放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔等導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡[5]。因此，在缺血再灌注過(guò)程中清除心肌細(xì)胞中的受損線粒體具有重要意義。而線粒體自噬可選擇性地降解多余或受損的線粒體，是一種以線粒體為目標(biāo)的特殊自噬形式。線粒體自噬于2005年由Lemasters[6]首次提出，線粒體自噬通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體的質(zhì)量與數(shù)量維持心肌細(xì)胞的正常運(yùn)行，但當(dāng)受到氧化應(yīng)激、缺血、缺氧等刺激時(shí)，過(guò)度的線粒體自噬或線粒體自噬不足均可影響心肌細(xì)胞的功能，甚至導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，因此應(yīng)嚴(yán)格控制心肌細(xì)胞中線粒體自噬的激活程度。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene,PTEN)誘導(dǎo)激酶1[phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene-inducible putative kinase 1，Pink1]/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是目前研究最廣泛的線粒體自噬途徑之一[7]?，F(xiàn)就Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在MIRI中的作用予以綜述。

1 Pink1、Parkin的結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)的線粒體自噬

1.1Pink1、Parkin的結(jié)構(gòu) Pink1蛋白含有581種氨基酸殘基，由N端線粒體靶向序列、跨膜結(jié)構(gòu)域、高度保守的激酶結(jié)構(gòu)組成[8]。Pink1蛋白作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶發(fā)揮作用[9]，在基礎(chǔ)條件下，Pink1蛋白的N端線粒體靶向序列在線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶和線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶的作用下將Pink1導(dǎo)入線粒體內(nèi)[10]，然后再經(jīng)線粒體處理肽酶、早老蛋白相關(guān)菱形蛋白酶的水解，使Pink1保持在較低水平[11]。Parkin是一種E3泛素連接酶，由465種氨基酸組成，其N端是一個(gè)泛素樣結(jié)構(gòu)域，可以被Pink1磷酸化激活[12]，一般情況下，Parkin主要位于胞質(zhì)中，其E3泛素連接酶的活性被自動(dòng)抑制。

1.2Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬 Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是目前最經(jīng)典的線粒體自噬途徑，因其基因突變與帕金森病相關(guān)而得名[13]。在缺血、缺氧等刺激下，線粒體由有氧代謝轉(zhuǎn)化為厭氧代謝，導(dǎo)致電子傳遞鏈功能障礙、線粒體外膜去極化，使線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶、內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶以及相關(guān)線粒體水解酶無(wú)法正常工作，進(jìn)而導(dǎo)致Pink1的轉(zhuǎn)位和降解被阻斷，從而聚集在線粒體上[14]；然后，Pink1通過(guò)磷酸化Parkin的絲氨酸65殘基激活Parkin，將Parkin從自抑制狀態(tài)釋放出來(lái)[15]；同時(shí)，Pink1在絲氨酸65處磷酸化泛素，進(jìn)一步激活Parkin[16]；另外，Pink1也可以在蘇氨酸11和絲氨酸42處磷酸化線粒體外膜融合蛋白2，招募Parkin聚集[17]；最后，Parkin泛素化線粒體外膜蛋白，泛素化的線粒體外膜蛋白與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3結(jié)合，將受損線粒體分離到自噬體中，再與溶酶體融合將受損線粒體降解[18]。Pink1缺失可抑制Parkin向線粒體轉(zhuǎn)移，Parkin常作為Pink1的下游分子起作用，而在缺乏Pink1的細(xì)胞中，Parkin也可以轉(zhuǎn)移至去極化的線粒體上[19]。Pink1和Parkin缺失均會(huì)降低細(xì)胞對(duì)受損線粒體的降解能力[20]，導(dǎo)致受損細(xì)胞器累積及細(xì)胞死亡。因此，Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬對(duì)于細(xì)胞生存具有重要意義。

2 Pink1/Parkin及其介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控

2.1Pink1的磷酸化與Parkin的泛素化調(diào)控 線粒體外膜去極化后，聚集在其表面的Pink1可以通過(guò)磷酸化泛素來(lái)激活和招募Parkin，而含EF-hand結(jié)構(gòu)域2的蛋白磷酸酶可拮抗Pink1的磷酸酶，使泛素去磷酸化，抑制Pink1依賴的線粒體自噬[21]。蛋白磷酸酶PTEN-L也可抑制泛素磷酸化，阻斷磷酸化泛素鏈的形成；此外，PTEN-L還可防止Parkin向線粒體的移位，抑制Parkin的E3泛素連接酶活性，并阻止其誘導(dǎo)的線粒體自噬[22]。因此，Pink1的磷酸化對(duì)Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的發(fā)生具有重要作用。在Parkin泛素化功能的調(diào)節(jié)中，泛素特異性蛋白酶30可對(duì)抗Parkin介導(dǎo)的泛素化功能[23]，抑制線粒體自噬的發(fā)生。而泛素特異性蛋白酶33可以從Parkin中去除K6、K11、K48和K63連接的泛素偶聯(lián)物，在Lys435處使Parkin去泛素化，抑制Parkin蛋白轉(zhuǎn)移至去極化的線粒體上，從而抑制線粒體自噬的發(fā)生[24]。因此，Pink1的磷酸化功能與Parkin泛素化功能的調(diào)控可以影響其介導(dǎo)的線粒體自噬的激活，達(dá)到控制線粒體質(zhì)量和數(shù)量平衡的目的。

2.2Pink1/Parkin基因和蛋白修飾的調(diào)控 Pink1/Parkin基因突變以及轉(zhuǎn)錄后的蛋白修飾均可影響線粒體自噬的功能。研究發(fā)現(xiàn)，Pink1的S-亞硝?；揎椏蓽p少Parkin向線粒體膜的轉(zhuǎn)移，抑制線粒體自噬的發(fā)生[25]。在Pink1轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，p53作為一種轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)抑制Pink1啟動(dòng)子、信使RNA及蛋白水平控制Pink1及其介導(dǎo)的線粒體自噬[26]。微RNA(microRNA，miRNA/miR)-27a和miR-27b基因可以Pink1信使RNA的3′非翻譯區(qū)為靶點(diǎn)，抑制Pink1的表達(dá)，阻止線粒體上Parkin的易位和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ的積累[27]，從而抑制線粒體自噬。另有報(bào)道顯示，導(dǎo)向RNA設(shè)計(jì)可以重新編碼Pink1(W437X)的缺失突變，挽救Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬[28]。而靶向miR-218可降低Parkin信使RNA和Parkin蛋白水平并解除其E3泛素連接酶的作用，從而負(fù)向調(diào)節(jié)Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬[29]。核呼吸因子1可同時(shí)調(diào)控Pink1和Parkin基因的轉(zhuǎn)錄，影響Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，進(jìn)而參與線粒體質(zhì)量控制[30]。由于基因調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后蛋白修飾可直接調(diào)節(jié)Pink1、Parkin蛋白水平，因此對(duì)于未來(lái)更精確把控Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬具有指導(dǎo)作用。

2.3氧化應(yīng)激對(duì)Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的調(diào)控 有證據(jù)表明，ROS是線粒體自噬的必要條件[31]。羰基氰化物間氯苯腙可誘導(dǎo)線粒體去極化和ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)Parkin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體中，然后通過(guò)線粒體自噬途徑清除受損線粒體[32]。而羰基氰化物間氯苯腙的作用可能是將過(guò)氧化物酶6招募到去極化的線粒體上[33]，在Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的初始階段控制ROS的穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)線粒體自噬[34]。另有研究顯示，鄰苯二甲酸二-2-乙基己基酯作為一種內(nèi)分泌干擾物可通過(guò)增加ROS的產(chǎn)生，降低線粒體膜電位，進(jìn)而激活Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬通路[35]。除了羰基氰化物間氯苯腙、鄰苯二甲酸二-2-乙基己基酯誘導(dǎo)的ROS應(yīng)激反應(yīng)外，毒死蜱、1,4-苯醌也能夠降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)ROS生成和Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬[36-37]。綜上可知，氧化應(yīng)激是Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬發(fā)生的重要調(diào)控因素，因此可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激水平避免Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的過(guò)度激活。

3 Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在MIRI中的作用

3.1心肌細(xì)胞中的Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在MIRI的作用 缺血再灌注損傷分為缺血性損傷和再灌注損傷兩部分。Kubli等[38]利用小鼠永久性冠狀動(dòng)脈左前降支閉塞建立體內(nèi)梗死模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺乏Parkin基因小鼠對(duì)心肌梗死更為敏感，首次證明了Parkin基因在心臟中的保護(hù)作用。增加缺血、缺氧心肌中線粒體的Parkin易位，促進(jìn)其參與的線粒體自噬，可以減少缺血、缺氧對(duì)心肌的損傷[39]。Siddall等[40]利用小鼠缺血再灌注損傷模型也證實(shí)了Pink1保護(hù)心肌的作用，該研究發(fā)現(xiàn)敲除Pink1基因的缺血再灌注小鼠的心肌梗死更顯著，同時(shí)對(duì)ROS誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化也更敏感。而且，在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中構(gòu)建高表達(dá)Pink1，可以穩(wěn)定線粒體電子傳遞鏈活性，抑制ROS生成，減少缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷[41]。綜上，通過(guò)激活Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可以顯著改善心肌梗死面積[42]。因此，可以通過(guò)促進(jìn)Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，清除受損線粒體在心肌中的累積，減少M(fèi)IRI時(shí)心肌細(xì)胞的損傷。

雖然缺血再灌注后上調(diào)的線粒體自噬具有心肌保護(hù)作用，但再灌注時(shí)線粒體自噬將被過(guò)度激活，因此抑制Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可保護(hù)心肌免受缺血再灌注損傷。如Ji等[43]發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧增加了Pink1/Parkin與線粒體的共定位，激活了其介導(dǎo)的線粒體自噬；但經(jīng)乙醛脫氫酶2激活劑Alda-1處理后，Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬被抑制，阻止了ROS和線粒體超氧化物的積累，保護(hù)心肌免受缺血再灌注損傷。Zhou等[44]在離體大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，Notch1可通過(guò)抑制Pink1表達(dá)以及線粒體外膜融合蛋白2和Parkin的磷酸化，抑制缺血再灌注損傷作用下的心肌細(xì)胞線粒體自噬，減少心肌細(xì)胞損傷。另有研究提出，通過(guò)藥物處理可以恢復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，降低細(xì)胞對(duì)線粒體自噬的需求，但并不是直接通過(guò)抑制線粒體自噬的過(guò)度激活而保護(hù)心肌細(xì)胞[45]，為線粒體自噬的調(diào)控提供新思路。

3.2血小板中的Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在MIRI中的作用 盡管心肌細(xì)胞是缺血再灌注損傷的潛在靶細(xì)胞，但心肌細(xì)胞損傷主要由血小板微血栓形成和微循環(huán)灌注缺陷導(dǎo)致。在缺血再灌注時(shí)，血小板功能活化使其黏附并聚集于受損血管壁上并形成微血栓，降低心肌灌注；同時(shí)，血小板來(lái)源的5-羥色胺可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放髓過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫，導(dǎo)致梗死區(qū)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，加重心肌梗死[46]。因此，在缺血心肌中有必要控制血小板的活化程度。線粒體功能是血小板促凝血活性的關(guān)鍵，而線粒體損傷可導(dǎo)致血栓的形成，降低循環(huán)血流。在缺氧誘導(dǎo)的血小板線粒體損傷中，受損線粒體可以被線粒體自噬途徑降解[47]，從而降低血小板活性，最終減輕MIRI。另外，主要的線粒體自噬基因FUN14域蛋白1、類NIP3蛋白X和Parkin等被敲除后，可以引起血小板中受損線粒體的積聚，導(dǎo)致梗死面積增加[48]。因此，血小板的線粒體自噬是心肌細(xì)胞免受缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一。在正常健康的血小板線粒體中，Pink1缺失的血小板線粒體自噬功能正常，Pink1不調(diào)節(jié)正常血小板中的線粒體自噬,表明在應(yīng)激狀態(tài)下血小板可以通過(guò)提高線粒體自噬水平應(yīng)對(duì)環(huán)境變化，發(fā)揮自我保護(hù)功能[49]。

3.3微血管中的Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在MIRI中的作用 血管壁由管腔側(cè)的內(nèi)膜、中膜和外膜三層組織構(gòu)成。內(nèi)膜由單層內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮下結(jié)締組織組成，單層內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌內(nèi)皮素、一氧化氮等擴(kuò)張血管的活性物質(zhì)；中層主要由血管平滑肌細(xì)胞和彈性結(jié)締組織組成，賦予血管壁穩(wěn)定性和彈性[50]。腺苷酸活化蛋白激酶α與血管平滑肌細(xì)胞增殖及內(nèi)膜增生密切相關(guān)[51]。Zhou等[52]發(fā)現(xiàn)，褪黑素可通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞的腺苷酸活化蛋白激酶α抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放和膜電位下降，阻止Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬過(guò)度激活，從而改善內(nèi)皮屏障功能，恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞分泌擴(kuò)血管的物質(zhì)，減輕心臟微血管缺血再灌注損傷。血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵因素之一，而Apelin-13具有調(diào)節(jié)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的功能。據(jù)He等[53]報(bào)道，Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬通過(guò)腺苷酸活化蛋白激酶α促進(jìn)Apelin-13誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成，進(jìn)而致血管腔狹窄，降低心肌灌注。另外，在氧化低密度脂蛋白處理的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，核受體亞家族4 A組成員1通過(guò)鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)Parkin的激活，促進(jìn)其介導(dǎo)的線粒體自噬，從而參與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和動(dòng)脈粥樣硬化形成[54]。由此可見(jiàn)，Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬與血管動(dòng)脈粥樣硬化的形成有關(guān)，但目前關(guān)于在MIRI中Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬調(diào)節(jié)血管動(dòng)脈粥樣硬化形成的報(bào)道較少。由于動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心肌缺血的主要原因之一，而對(duì)于缺血心肌有效的治療方法為再灌注，因此未來(lái)可以將Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬、動(dòng)脈粥樣硬化及MIRI聯(lián)系起來(lái)，以更好地預(yù)防及減少M(fèi)IRI。

4 小 結(jié)

在心肌細(xì)胞和血小板中適度激活線粒體自噬有助于減少心肌梗死面積。在微血管系統(tǒng)中抑制線粒體自噬可以改善血管通透性，減少動(dòng)脈粥樣硬化的形成，確保心肌的有效灌注。但目前在血小板和微血管系統(tǒng)中關(guān)于Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的研究仍較少，Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在缺血再灌注中的作用也仍存在爭(zhēng)議。線粒體自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，調(diào)控其適度激活具有一定難度，且在單一靜態(tài)時(shí)間點(diǎn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)或蛋白質(zhì)印跡法評(píng)估Pink1/Parkin的表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果，因此未來(lái)需對(duì)線粒體自噬進(jìn)行全面評(píng)估，以為把控MIRI中線粒體自噬的激活程度提供指導(dǎo)，從而減少M(fèi)IRI帶來(lái)的傷害。