梁麗英，陳晶，張永琴，藍艷梅，劉歡

(廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院1.醫(yī)學分子生物學實驗室；2.藥物臨床試驗機構辦公室，南寧 530023)

隨著人口快速老齡化，急性心肌梗死引起的死亡率不斷上升，對其的防治任務日益艱巨[1]，急性心肌梗死最理想的治療措施是在冠狀動脈已通的基礎上實現(xiàn)心肌水平的完全再灌注。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞在經(jīng)過一段時間缺血后，重新獲得血液供應，將會導致該部位心肌結(jié)構和功能的損傷，進一步加重心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia reperfu-sion injury，MIRI)。如何降低MIRI的發(fā)生具有極為重要的臨床意義。研究表明心肌細胞損傷是存在于多種心血管疾病中的共同病理現(xiàn)象，微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)在抗心肌細胞損傷上具有重要作用[4]，其通過調(diào)節(jié)其靶基因人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome tengene，PTEN)，調(diào)控心肌細胞的凋亡、增殖，參與氧化應激引起的細胞損傷[2-4]。

從中草藥中分離高效低毒活性成分，用于心肌梗死防治，是該領域的一個研究熱點[5-7]。黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-Ⅳ)是從中藥黃芪中分離得到的一種皂苷類化合物。藥理學研究顯示，黃芪甲苷對心血管系統(tǒng)主要有強心、耐缺氧、保護缺血心肌損傷等作用[8-9]，其作用機制仍不清楚。本研究通過建立對缺氧復氧大鼠心肌細胞損傷模型，利用流式細胞技術、實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)、免疫熒光等技術分析和探討miR-21/PTEN途徑在黃芪甲苷保護心肌細胞損傷過程中的作用機制，以期為黃芪應用于臨床治療心肌缺血引起的心血管疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞 心肌細胞H9c2，由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供 。

1.2藥品與試劑 黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院，每瓶20 mg，貨號：84687-43-4)；DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(FBS，美國Gibco公司，批號分別為C11885500BT，16000-044)；二甲亞砜(DMSO，索萊寶，批號：0231-100)為分析純； 0.25% 胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(Gibco，批號：25200056)；磷酸鹽緩沖液(PBS，索萊寶，批號：P1022-500)；凋亡試劑盒Annexinv-APC/PI(美國BD公司，批號：7180833)；細胞色素C(Cyt-c，上海江萊生物科技有限公司，貨號：JL11434)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A)以及熒光定量檢測試劑盒(TB GreenTM Premix ExTaqTM II，RR820A)均購自大連寶生物公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)試劑盒(武漢博士德，貨號：EK1425)；CCK-8試劑(cell counting kit-8，CCK-8，日本同仁，貨號：CK04)；小鼠抗人B淋巴細胞瘤-2 基因( B-cell lymphoma-2，Bcl-2，武漢博士德，貨號：BM0200) 單 克 隆 抗 體；miR-21 模擬物(miR-21mimic) 和 miR-21抑制物 (miR-21 inhibitor)慢病毒由上海吉凱生物公司包裝合成，測定病毒滴度后置于-80 ℃保存。

1.3儀器 流式細胞儀(美國貝克曼，CytoFlex)、低溫高速離心機(德國eppendorf，5410)、生物安全柜(BIOBASE，BSC-3FA2)、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國賽默飛)、三氣培養(yǎng)箱(美國賽默飛HERAcell 150i)、酶標儀(美國賽默飛)、倒置熒光顯微鏡(日本Olympus，IX71)、7500 Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng) (美國Applied Biosystems)。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng)和缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R) 模型建立[8]H9c2接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10% 胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 U·mL-1鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液。待細胞長至約80%，用0.25% 胰蛋白酶消化傳代，進行下一步實驗。經(jīng)過條件摸索確定H9c2缺氧復氧模型復制方法：細胞傳代鋪板常規(guī)培養(yǎng)24 h后，缺氧缺糖培養(yǎng)12 h(換成無血清無糖培養(yǎng)基后，置于三氣培養(yǎng)箱中 (1%O2，94%N2，5%CO2)孵育12 h，再復氧6 h(換成培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱孵育6 h)。

1.4.2miR-21過表達(miR-21 mimic)和干擾 miR-21(miR-21 inhibitor)慢病毒穩(wěn)定細胞的轉(zhuǎn)染 將H9c2單細胞懸液接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(5×105個·mL-1)，待細胞長至約80%時，按照50 MOI(multiplicity of infection，MOI)的接種病毒量分別接種miR-21過表達和干擾慢病毒至H9c2細胞，接種病毒后12 h吸棄培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后熒光顯微鏡及流式細胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率>90%達到實驗要求，為穩(wěn)定表達miR-21 mimic 或 miR-21 inhibitor細胞，傳代細胞進行下一步實驗。

1.4.3篩選合適心肌細胞生長的黃芪甲苷濃度

①藥物黃芪甲苷的制備：根據(jù)前期的研究及參考文獻[8-10]，選用黃芪甲苷標準品，用時用DMSO溶解(DMSO終濃度<0.1%)。

②黃芪甲苷對H9c2細胞H/R損傷模型細胞增殖的影響：將一定量的生長狀態(tài)良好的心肌細胞消化后制成細胞懸液，以1×105個·mL-1的密度加入96 孔培養(yǎng)板上中間的孔中，細胞懸液每孔100 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱貼壁過夜，換成無血清無糖培養(yǎng)基后，置于三氣培養(yǎng)箱中 (1%O2、94%N2、5%CO2)孵育12 h，缺氧處理后將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后以建立缺氧/復氧模型。造模同時分別向各孔加入10 μL 以下各組藥物( 黃芪甲苷0，25，50，100， 200 μmol·L-1)，每組6個孔，作用至72 h。向每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度(A值)，篩選黃芪甲苷對H9c2細胞H/R損傷模型細胞增殖的影響。

1.4.4細胞分組與處置 取對數(shù)生長期細胞，傳代鋪板后隨機分為以下6組：正常組 (正常培養(yǎng)72 h)、H/R模型組 (缺氧復氧造模)、H/R+miR-21 mimic組(造模前預先轉(zhuǎn)染miR-21 mimic )、H/R+miR-21 inhibitor組 (造模前預先轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor)、H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ(造模和AS-Ⅳ干預之前預先轉(zhuǎn)染miR-21 mimic組，造模同時予200 μmol·L-1AS-Ⅳ干預至72 h)、H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ(造模和AS-Ⅳ干預之前預先轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor，造模同時予200 μmol·L-1AS-Ⅳ干預至72 h) 。

1.4.5qRT-PCR檢測PTEN、miR-21基因的表達水平 取對數(shù)生長期的細胞以2×105個·mL-1的密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，按分組要求，經(jīng)藥物孵育72 h后用胰酶消化收集所有細胞使用TRizol法提取細胞總RNA，使用Nandrop2000進行濃度、純度檢測后，按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)NCBI參考序列，設計針對大鼠PTEN、的特異性PCR引物，PTEN (上游序列：ATTCCCAGTCAGG-CGCTA；下游序列：TCACCTTTAGCTGGCAGACC)，擴增根據(jù)TB GreenTM Premix ExTaqTM II，RR820A試劑盒說明書，擴增后的原始CT值采用2-△△CT方法計算后分析目的基因PTEN的相對表達水平。

使用天根miRcute miRNA提取分離試劑盒提取各組細胞miRNA后，使用miRcute 增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒對所得miRNA同步進行加A尾反應和逆轉(zhuǎn)錄反應。對逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物采用miRcute增強型 miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)進行qRT-PCR。qRT-PCR擴增后的原始CT值采用2-△△CT方法計算后進行相對定量分析基因表達水平。

1.4.6用流式細胞技術檢測心肌細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞以2×105個·mL-1的密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，按分組要求處理，經(jīng)藥物孵育72 h后用不含EDTA的胰酶消化收集所有細胞胰酶消化細胞，制成單細胞懸液，按凋亡試劑盒說明書，取100 μL細胞懸液加入5 mL的流式管中，加入Annexinv-APC和PI各5 μL，同時設定對照：對照1，單純的活細胞，不加任何染料；對照2，活細胞只加Annexinv-APC；對照3，活細胞只加PI，輕輕混勻，室溫、避光孵育15 min，加入連接緩沖液400 μL，1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測，分析結(jié)果。

1.4.7用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和細胞色素C(Cyt-C)的表達 取對數(shù)生長期的細胞以2×105個·mL-1的密度接種于 6 孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜，按分組要求經(jīng)藥物孵育72 h后用胰酶消化收集所有細胞，每樣本細胞數(shù)大于1×106個·mL-1，用預冷PBS洗1次，將細胞重懸于PBS中，反復凍融3次后3000 r·min-1離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書要求檢測。

1.4.8免疫熒光檢測Bcl-2蛋白的表達 取對數(shù)生長期的細胞以2×105個·mL-1的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5 mL，貼壁過夜，按分組要求處理，細胞按要求處理后，從培養(yǎng)箱中取出，PBS洗3次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次；0.5%Trito-X-100室溫通透20 min；PBS洗3次，吸水紙吸干PBS，在培養(yǎng)孔里滴加正常的山羊血清，封閉30 min；吸水紙吸干封閉液，每孔滴加一抗并放入濕盒，4 ℃過夜；PBS洗3次，加入二抗，濕盒中孵育1 h，PBS洗3次；復染核，滴加DAPI避光5 min，洗去多余的DAPI，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.5統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0版軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，在方差齊性的前提下通過One-Way ANOVA分析進行各組樣本均數(shù)間的多重比較，方差不齊時采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染效率鑒定結(jié)果 熒光相差倒置顯微鏡下可見細胞形態(tài)完整，呈纖維狀，轉(zhuǎn)染72 h后，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞攜帶熒光(綠色)，流式檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率>90%，符合后續(xù)實驗要求，見圖1。

2.2黃芪甲苷對缺氧復氧心肌細胞H9c2增殖的影響 與0 μmol·L-1黃芪甲苷組比較，200 μmol·L-1的黃芪甲苷作用于細胞，吸光度A值顯著提高，A值與細胞增殖呈正相關，根據(jù)增殖的能力，選用200 μmol·L-1的黃芪甲苷作用于細胞作為后續(xù)的實驗條件。見表1。

2.3黃芪甲苷對缺氧復氧損傷細胞H9c2 miR-21、PTEN表達的影響 與H/R模型組比較，正常對照組、H/R+miR-21 mimic組 miR-21的表達量增加、PTEN表達量明顯減少，H/R+miR-21 inhibitor組miR-21的表達量下降、PTEN表達量明顯增加；與H/R+miR-21 mimic組比較，H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ組miR-21的表達量增加，PTEN表達量明顯減少；與H/R+miR-21 inhibitor組比較，H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組miR-21的表達量增加、PTEN表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表2。

2.4黃芪甲苷對缺氧復氧損傷心肌細胞H9c2凋亡百分率的影響 與H/R模型組比較，正常對照組、H/R+miR-21 mimic組凋亡百分率降低，H/R+miR-21 inhibitor組凋亡百分率增加；與H/R+miR-21 mimic組比較，H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ組凋亡百分率降低；與H/R+miR-21 inhibitor組比較，H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組miR-21的凋亡百分率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2和表3。

2.5黃芪甲苷對缺氧復氧損傷心肌細胞H9c2 Caspase-3、Cyt-C表達的影響 與H/R組比較，正常對照組、H/R+miR-21 mimic組Caspase-3和Cyt-C的表達降低，H/R+miR-21 inhibitor組Caspase-3和Cyt-C的表達增加；與H/R+miR-21 mimic組比較，H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ組Caspase-3和Cyt-C的表達降低；與H/R+miR-21 inhibitor組比較，H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組Caspase-3和Cyt-C的表達降低(P<0.05或P<0.01)。見表4。

2.6黃芪甲苷對缺氧復氧損傷細胞H9c2 Bcl-2蛋白表達的影響 與H/R組比較，正常對照組、H/R+miR-21 mimic 組形態(tài)完整，細胞核清晰，如圖藍色熒光顯示，Bcl-2蛋白(表達紅色熒光)的表達量減少，與H/R+miR-21 mimic組比較，H/R+ miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組Bcl-2的表達量減少；與H/R+ miR-21 inhibitor組比較，H/R+ miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組Bcl-2的表達量減少，如圖3所示。

3 討論

國家心血管病中心編撰出版的《中國心血管病報告2019》[1]指出，中國心血管病患病率處于持續(xù)上升階段。心血管疾病中以急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的臨床癥狀最為嚴重，研究AMI的發(fā)生、發(fā)展過程，尋求有效的治療藥物尤為重要。miR-21及其靶基因 PTEN 在心血管疾病調(diào)控的過程中發(fā)揮的作用受到人們的關注，其對心臟的保護作用被證實[11]。研究表明，miR-21 可以通過抑制其靶基因PTEN的表達而減輕急性心梗后心肌功能的損傷，同時減少心肌細胞的凋亡，明顯地抑制氧化應激及缺血再灌注引起的心肌細胞損傷[12]。本實驗采用研究心肌保護作用常用的體外模型H9c2細胞，模擬心肌細胞的缺血再灌注，通過體外缺氧/復氧的模型，試圖從調(diào)節(jié)miR-21的表達水平及其對靶基因PTEN的調(diào)節(jié)尋求黃芪甲苷對心肌細胞的保護作用機制及靶點。

圖1 心肌細胞H9c2轉(zhuǎn)染形態(tài)圖(×100)

表1 黃芪甲苷對缺氧復氧心肌細胞H9c2增殖的影響

結(jié)果顯示，黃芪甲苷能明顯抑制缺氧/復氧心肌細胞的凋亡。黃芪甲苷能上調(diào)缺氧復氧損傷心肌細胞miR-21的表達量，進一步下調(diào)損傷心肌細胞PTEN的表達，抑制心肌細胞凋亡。Bcl-2是凋亡分子機制研究的主要靶分子，Caspase-3是凋亡過程中的執(zhí)行分子，缺氧復氧損傷可誘導線粒體腫脹，增加線粒體膜的通透性，當線粒體接收到凋亡刺激信號，通過釋放內(nèi)外膜間隙里的促凋亡因子，如Cyt-C等，進一步激活下游凋亡通路的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶相關蛋白(Caspase)，包括Caspase-9和Caspase-3，參與介導細胞凋亡過程[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧/復氧損傷后，黃芪甲苷能減少Cyt-C、Caspase-3的釋放，抑制細胞凋亡。

表2 黃芪甲苷對缺氧復氧損傷心肌細胞H9c2 miR-21、PTEN表達的影響

A.正常對照組；B.H/R模型組；C.H/R+miR-21 mimic 組；D.H/R+ miR-21 inhibitor組；E.H/R+miR-21 mimic +AS-Ⅳ組；F.H/R+miR-21 inhibitor +AS-Ⅳ組。

表3 黃芪甲苷對缺氧復氧損傷心肌細胞H9c2 凋亡率的影響

表4 黃芪甲苷對缺氧復氧損傷心肌細胞H9c2 Caspase-3、Cyt-C表達的影響

Tab.4 The effect of Astragaloside on the expression level of Caspase-3 and Cyt-C in hypoxia/reoxygenation injury

組別Caspase-3Cyt-c正常對照組0.63±0.75①1.49±0.13①H/R模型組3.03±0.182.76±0.20H/R+miR-21 mimic組2.35±0.60①2.18±0.12① inhibitor組3.57±0.08①3.71±0.09① mimic+AS-Ⅳ組41.46±0.14①②1.50±0.12①②inhibitor+AS-Ⅳ組2.02±0.13①③2.35±0.28①③F42.9096.74P0.000.00

A.正常對照組；B.H/R模型組；C.H/R+miR-21 mimic 組；D.H/R+ miR-21 inhibitor組；E.H/R+miR-21 mimic+AS-Ⅳ組；F.H/R+miR-21 inhibitor+AS-Ⅳ組。

綜上所述，黃芪甲苷抑制缺氧復氧損傷的心肌細胞的凋亡，其機制可能是上調(diào)了miR-21的表達，靶向調(diào)控PTEN，抑制了相關促凋亡因子Cyt-C、Caspase-3的釋放。 miR-21作為一類具有重要調(diào)控作用的內(nèi)源性小分子廣泛參與了機體多種生物學過程的調(diào)控，它在心血管系統(tǒng)多種生理、病理過程也具有重要的調(diào)控作用。從miR-21對心血管系統(tǒng)的調(diào)控和作用機制研究心血管疾病，將有助于發(fā)現(xiàn)更多天然藥物對心血管疾病的作用靶點。然而，本研究僅選擇了心肌細胞的缺氧/復氧離體損傷模型，為進一步確證黃芪甲苷對缺血性心臟疾病的保護作用，下一步仍需進行大鼠心肌缺血等整體動物實驗研究。