毛菊苣中母菊素的體外抗肝纖維化作用*

努力比亞·阿不都克尤木，秦冬梅，胡利萍，侯金秋，魯曉擘

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，烏魯木齊 830054；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832002)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一種繼發(fā)于多種原因引起的急慢性肝損傷后的一種自我損傷修復(fù)反應(yīng)[1]，引起HF的因素有許多，其中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活躍、轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)長期大量沉積都是形成HF的主要因素[2-3]。而轉(zhuǎn)化生長因子-β1(tansforming growth facter beta 1，TGF-β1)是啟動和促進HSC向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵促纖因子[4-7]，主要以自分泌和旁分泌兩種形式促進HSC活化，并生成大量ECM，從而導(dǎo)致肝纖維化[8-9]。研究表明，在肝纖維化發(fā)展過程中常伴隨著TGF-β1/Smad家族胞漿蛋白表達(dá)的失調(diào)，梁冰潔等[10]研究發(fā)現(xiàn)在抗肝纖維化過程中，TGF-β1/Smad通路中的TGF-β1、Smad2、Smad4 以及Smad7 mRNA發(fā)揮重要作用。因此TGF-β1/Smad通路中的TGF-β1、Smad2、Smad3和負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號分子Smad7在肝纖維化中發(fā)揮主要作用[11-12]。

菊苣系菊科植物毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)或菊苣(CichoriumintybusL.)的干燥地上部分或根[13]，毛菊苣作為菊科菊苣屬植物，具有良好的藥理活性以及藥用價值。本課題組前期研究表明毛菊苣根粗提物中有效成分具有良好的抗肝纖維化作用[14]，但對于毛菊苣根部得到的倍半萜內(nèi)酯類化合物192號的抗肝纖維化作用機制研究筆者未見報道。本文通過192號對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用及作用機制研究，進而探討毛菊苣抗肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期獲得抗肝纖維化先導(dǎo)化合物。

1 試劑與儀器

1.1儀器 電子天平(德國Sartorius，感量：0.01 mg，型號：BP211D)；優(yōu)普特實驗超純水機(成都超純科技有限公司，型號：UPT-11-10T)；高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司，型號：Sorvall Legend Micro 17R)；倒置顯微鏡(日本Nikon公司，型號：T2R)；-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司，型號：TDE40086FA)；PCR熒光定量儀(美國羅氏，型號：LightCycler 480)；凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司，型號：EC3600)；CO2孵育箱(美國Thermo Fisher公司)；梯度基因擴增儀[北京大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司，型號：TC1000-G]；快速混勻器(國華電器，型號：SK-1)；生物安全柜(德國Heraeus，型號：Hearsafe)。

1.2藥品與試劑 大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院提供)；192號化合物為實驗室自制；胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司，批號：1828728)；DMEM Basic培養(yǎng)基(Gibco公司，批號：8119445)；HIFIScript cDNA Synthesis Kit(康為世紀(jì)，批號：30441)；瓊脂糖(Biowest Agarose公司，AGARose G-10)；QPCR引物(生工生物公司)；CR Master Mix(Thermo scientific)；TGF-β1(Bioworld Technology公司，批號：1218209)；MTT(Sigma公司)；EvaGreen染料(Biotium公司，批號：31000)；M-MLV第一鏈合成試劑盒(invitrogen公司，批號：C20012500BT)；PBS PH7.2Basix(10x)(批號：20140310)、胰酶(批號：20200824)、青霉素-鏈霉素雙抗(10 000 U)(均購自Solarbio公司)；Taq酶(批號：J20728)、DEPC(批號：04207)、TRNZOL Universal Reagent試劑(批號：P4621)、核酸染料、6xDNALoading Buffer(均購自天根公司)；二甲亞砜(DMSO)、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇(均購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1供試品的制備 將毛菊苣根10 kg，切斷成長度1～1.5 cm，用95%乙醇回流提取，濃縮得到提取物浸膏1.28 kg，然后使用正丁醇萃取，將萃取部位上AB-8大孔吸附樹脂，先用水洗脫，再依次用30%，60%與90%乙醇洗脫，洗脫液濃縮后，再用十八烷基硅烷鍵合硅膠填料(octadecyl silane bonded silicagel，ODS)為填料，不同比例的甲醇溶液為流動相進行洗脫；所得餾分再用Sephadex LH-20為填料進行分離，即獲得倍半萜內(nèi)酯類成分192號單體化合物。

2.1.2供試品的測定 毛菊苣中提取得到的母菊素(化學(xué)名：8-去乙酰母菊素-8-O-硫酸鹽，192號)化合物經(jīng)測定，其結(jié)構(gòu)式見圖1，該化合物首次從毛菊苣中分離得到。

2.1.3192號化合物對HSC-T6增殖作用影響[15]取對數(shù)生長期的HSC-T6，以1×105個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入濃度為5，10，20，40，80 μmol·L-1的192號化合物處理細(xì)胞，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入MTT溶液每孔20 μL，孵育4 h，棄培養(yǎng)基，加入DMSO裂解細(xì)胞，用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測吸光度A值，按公式計算細(xì)胞生長抑制率(R)。存活率=(藥物組A值/對照組A值)×100%；抑制率=[1-(藥物組A值/對照組A值)]×100%。

2.1.4RT-PCR法檢測各組mRNA表達(dá)的影響[16]

①提取RNA。將HSC-T6細(xì)胞以1×105個·mL-1接種在6孔板內(nèi)孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，正常對照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h及48 h，模型對照組和給藥組加入終濃度為5 ng·mL-1TGF-β1的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h/48 h，另外給藥組分別加入終濃度為10，20，40 μmol·L-1的192號化合物共同培養(yǎng)24 h/48 h，收集各時間點的細(xì)胞，按照TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA。

城市地下綜合管廊，即在城市地下建造一個隧道空間，將電力、通信、燃?xì)狻⒐?、給排水等各種工程管線集于一體，實施統(tǒng)一規(guī)劃、統(tǒng)一設(shè)計、統(tǒng)一建設(shè)和管理，不僅有效利用了道路下的空間，節(jié)約了城市用地，還極大方便了各種市政設(shè)施的維護和檢修。將城市地下綜合管廊建設(shè)成三維地理信息模型數(shù)據(jù)，有利于管理者進行高效的管理和做出應(yīng)急處理決策等。

②RT-PCR引物設(shè)計。根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物見表1。

表1 特異性擴增引物

③RT-PCR。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)程序為42 ℃，40 min；85 ℃，5 min；4 ℃，10 min后放置于-80 ℃保存，取出cDNA按Real Time PCR說明進行反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；59 ℃，10 s；72 ℃，8 s，擴增45個循環(huán)，做溶解曲線又分3步：95 ℃，0 s；65 ℃，15 s；95 ℃，0 s繼續(xù)，40 ℃，30 s。

④熒光定量PCR結(jié)果計算。本研究采用的定量數(shù)據(jù)分析方法是2-△△CT法[17]。根據(jù)所測得CP值，求出待測基因平均CP值相對于GAPDH基因平均CP值的差值，進行歸一化，即用目的基因平均CP值減去管家基因平均CP值得到差值，然后對△CT進行歸一化，△△CT=△CT(靶基因)-△CT(共用靶基因?qū)φ?，再用2-△△CT求出相對同一對照的表達(dá)差異。

2.1.5Western blotting檢測蛋白表達(dá)水平 將HSC-T6細(xì)胞以1×105個·mL-1接種在6孔板內(nèi)孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，正常對照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h，模型對照組和給藥組加入終濃度為5 ng·mL-1TGF-β1的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h，另外給藥組分別加入終濃度為10，20，40 μmol·L-1劑量的192號化合物共同培養(yǎng)24 h后，用BCA進行蛋白定量，加上樣緩沖液，沸水煮沸15 min用于Western blotting蛋白檢測。根據(jù)1：1000(TGF-β1)、1：1000(smad3)、1：1000(smad7)、1：2000(β-actin)、1：5000(二抗)的稀釋比例進行孵育。檢測TGF-β1、Smad3和Smad7的蛋白表達(dá)，驗證其過表達(dá)及干擾效果。

2.2結(jié)果

2.2.1192號化合物對HSC-T6 細(xì)胞增殖的影響 MTT法測定細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示192號化合物可顯著抑制HSC-T6的增殖，在濃度為20 μmol·L-1時對HSC-T6的抑制率為46.97%，隨著藥物濃度增大反而抑制率下降，說明該藥物濃度在20 μmol·L-1對HSC-T6增殖的抑制作用較強，結(jié)果見圖2。

圖2 192號化合物對HSC-T6增殖的抑制作用

細(xì)胞給藥48 h后HSC-T6細(xì)胞mRNA表達(dá)的變化與模型組比較，192號化合物中、高濃度組顯著下調(diào)Smad3 的mRNA表達(dá)，對于Smad2、Smad7以及TGF-β1mRNA的表達(dá)作用效果不明顯，細(xì)胞給藥48 h mRNA表達(dá)結(jié)果見圖4。

RT-PCR實驗表明，192號化合物在TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞24/48 h后均能顯著下調(diào)大鼠肝星狀細(xì)胞中TGF-β1、Smad2和Smad3 mRNA表達(dá)水平，上調(diào)Smad7 mRNA表達(dá)水平，實驗考察了TGF-β1分別刺激HSC-T6細(xì)胞24/48 h，結(jié)果顯示TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞24 h的作用效果顯著，明顯優(yōu)于TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞48 h的效果，由此表明192號化合物在TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞24 h時能發(fā)揮最佳效果。

1.正常對照組；2.模型對照組；3.10 μmol·L-1藥物組；4.20 μmol·L-1藥物組；5.40 μmol·L-1藥物組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05；③與模型對照組比較，P<0.01。

2.2.3192號化合物對HSC-T6 細(xì)胞中TGF-β1、Smad3和Smad7蛋白水平影響 Western blotting結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞的TGF-β1，Smad3的蛋白水平顯著升高而Smad 7的蛋白水平明顯降低，與模型組比較，192號化合物不同濃度組的TGF-β1和Smad3的蛋白水平表達(dá)均降低而Smad 7的蛋白水平升高，192號化合物的中劑量20 μmol·L-1和高劑量40 μmol·L-1使活化后的HSC-T6細(xì)胞的TGF-β1和Smad3的蛋白水平表達(dá)顯著降低，同時192號化合物能夠明顯上調(diào)Smad7的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明192號化合物參與發(fā)揮抗肝纖維化是通過下調(diào)TGF-β1/Smad通路中TGF-β1和Smad3的蛋白表達(dá)以及上調(diào)Smad7的蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖5。

3 討論

肝纖維化與HSC的活化和增殖密切相關(guān)，HSC通過抑制膠原酶活性使ECM 的降解減少，ECM大量堆積從而形成肝纖維化。盡管肝臟病變的發(fā)病機制各不相同，但肝纖維化生成最終共同途徑卻都與HSC活化相關(guān)，因此抑制HSC的活化是治療肝纖維化的一個重要途徑[18]。

1.正常對照組；2.模型對照組；3.10 μmol·L-1藥物組；4.20 μmol·L-1藥物組；5.40 μmol·L-1藥物組；①與正常對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05；③與模型對照組比較，P<0.01。

毛菊苣作為一種傳統(tǒng)的中藥材被用于治療多種疾病，其具有較好的生物活性以及藥用價值，其中保肝作用較為明顯，有研究表明，毛菊苣提取物對小鼠肝纖維化具有較好保護作用[19]。本研究首次對毛菊苣中提取出192號化合物倍半萜內(nèi)酯類化合物進行藥效考察，并發(fā)現(xiàn)其能顯著的抑制由TGF-β1刺激的HSC-T6細(xì)胞活化，而HSC-T6細(xì)胞活化在肝纖維化進程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。同時大量研究表明[20]，在肝纖維化發(fā)展過程中常伴隨著TGF-β1/Smad家族胞漿蛋白表達(dá)的失調(diào)，筆者發(fā)現(xiàn)192號化合物在TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞24 h后對TGF-β1、Smad3和Smad7 mRNA表達(dá)作用顯著，并且192號化合物能夠明顯抑制TGF-β1和Smad3通路蛋白的表達(dá)以及上調(diào)Smad7蛋白表達(dá)水平，從而抑制由肝纖維化引起的TGF-β1/Smad家族胞漿蛋白表達(dá)的異常調(diào)控。

綜上所述，192號化合物抗肝纖維化作用機制之一是抑制肝星狀細(xì)胞TGF-β1/Smad信號通路，通過抑制HSC-T6的激活、增殖以及ECM的合成，從而發(fā)揮抗纖維化作用。本研究為母菊素抗肝纖維化作用機制奠定實驗基礎(chǔ)。

①正常對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05；③與模型對照組比較，P<0.01。