于子優(yōu) 蔡宜佐 李偉 張文杰

【提要】 創(chuàng)傷、感染、腫瘤等各種原因?qū)е碌拇竺娣e皮膚及軟組織缺損是整形外科的常見病，皮膚擴(kuò)張、皮瓣移植、脂肪組織填充等是組織缺損修復(fù)的常用技術(shù)手段，而這些技術(shù)在應(yīng)用過程中仍然存在組織擴(kuò)張速度緩慢、擴(kuò)張皮膚回縮、移植皮瓣壞死、填充脂肪吸收率高等難題。我們前期建立了從人體脂肪組織中提取無細(xì)胞脂肪組織提取液(Cell-free fat extract，CEFFE)技術(shù)，該技術(shù)可以獲得富含各類生長(zhǎng)因子而不含活細(xì)胞的液體，具有調(diào)節(jié)炎癥、促血管新生、促細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡、抑制活性氧產(chǎn)生等多種生物學(xué)功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CEFFE在皮瓣移植、皮膚擴(kuò)張、脂肪移植、創(chuàng)面愈合、皮膚光老化等疾病中均有治療效果。本文就CEFFE技術(shù)在皮膚及軟組織再生修復(fù)中的應(yīng)用及前景進(jìn)行綜述。

創(chuàng)傷、感染、腫瘤等各種原因可以導(dǎo)致大面積的皮膚及軟組織缺損，自體組織移植是目前整形外科的主要手段，其中包括皮膚擴(kuò)張、皮瓣移植、脂肪組織填充等常用技術(shù)。而這些技術(shù)在應(yīng)用過程中仍然存在組織擴(kuò)張速度緩慢、擴(kuò)張皮膚回縮、移植皮瓣壞死、填充脂肪吸收率高等難題，其中擴(kuò)張及移植組織的血供重建是影響其治療效果的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)的藥物輔助新生血管形成效果并不明顯，近年來間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell，MSC)治療在組織再生修復(fù)中的作用得到了廣泛驗(yàn)證，特別是在皮膚及軟組織再生修復(fù)中取得了可靠的療效[1-3]。脂肪組織中分離獲得的基質(zhì)細(xì)胞(Stromal vascular fraction，SVF)可以提高皮膚擴(kuò)張效率[4]，提高顆粒脂肪移植的存活率[5-6]，體外培養(yǎng)擴(kuò)增的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose derived stem cell，ADSC)可以促進(jìn)難愈性創(chuàng)面的愈合[7-8]，但細(xì)胞治療仍面臨安全性、穩(wěn)定性、致瘤性等難題。研究表明，干細(xì)胞主要以旁分泌生長(zhǎng)因子的機(jī)制發(fā)揮作用，包括分泌促血管新生、免疫調(diào)節(jié)、抗細(xì)胞凋亡等因子[9-11]。如果能夠獲得MSC分泌的活性因子群，就有望建立無細(xì)胞介導(dǎo)的生物治療新技術(shù)。我們前期建立了從人體脂肪組織中提取無細(xì)胞脂肪組織提取液(Cell-free fat extract，CEFFE)的技術(shù)[12]，該技術(shù)可以獲得富含各類生長(zhǎng)因子而不含活細(xì)胞的液體，具有調(diào)節(jié)炎癥、促血管新生、促細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞凋亡、抑制活性氧產(chǎn)生等多種生物學(xué)功能，有望成為全新的無細(xì)胞介導(dǎo)的組織再生修復(fù)新技術(shù)。

1 CEFFE的由來與特征

2013年，Tonnard等提出了納米脂肪(Nanofat)的概念，通過對(duì)小孔徑抽脂管抽吸所得的微小顆粒脂肪進(jìn)行機(jī)械性乳化處理，過濾后獲得乳糜狀液體即為納米脂肪。將自體納米脂肪注射至下瞼區(qū)或淺表皺紋的真皮內(nèi)，術(shù)后4～6個(gè)月可見黑眼圈及淺表皺紋的明顯改善[13]。此后，納米脂肪逐步在修復(fù)皮膚缺損、改善瘢痕等方面得到應(yīng)用[14-17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米脂肪能促進(jìn)真皮增厚和新生血管形成，抵抗紫外線引起的皮膚光老化[18]；納米脂肪還可通過促進(jìn)血管新生顯著提高顆粒脂肪移植的存活率[19]。以往研究認(rèn)為，納米脂肪中存在具有活性的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，是其發(fā)揮治療功能的主要成分。為了探究納米脂肪的活性成分，我們對(duì)納米脂肪開展進(jìn)一步分析和探索，提取了不含活細(xì)胞和油滴成分的液體層，所獲得的液體稱為“無細(xì)胞脂肪組織提取液(CEFFE)”[12,20]，含有大量與組織再生修復(fù)相關(guān)的活性因子。蛋白芯片分析顯示，CEFFE含1 700多種蛋白；免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)，其中富含胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血小板衍生因子(PDGF)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等多種與組織再生修復(fù)相關(guān)的活性因子[20-21]，其因子組合與MSC分泌的因子組合相似，由此推測(cè)CEFFE可能與MSC一樣具有調(diào)節(jié)炎癥、促血管新生、促神經(jīng)再生、促細(xì)胞增殖、抑制活性氧產(chǎn)生、抗細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能，有望用于多種疾病的治療。

2 CEFFE技術(shù)在整形外科領(lǐng)域的適應(yīng)癥

2.1 皮瓣存活

體外研究顯示，CEFFE可以促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管；在裸鼠下肢缺血模型中，局部肌肉內(nèi)注射CEFFE可以挽救缺血下肢的壞死[20]；在大鼠游離皮瓣存活動(dòng)物模型中，局部皮下注射CEFFE可以提高皮瓣的存活率[21]。深入分析證實(shí)，CEFFE通過富含的生長(zhǎng)因子促進(jìn)新生血管形成，改善組織缺血，促進(jìn)組織存活與再生[20-21]。

2.2 顆粒脂肪移植存活

顆粒脂肪移植后的高吸收率是臨床一直希望解決的難題，移植脂肪的存活與組織的再血管化密切相關(guān)。在顆粒脂肪移植裸鼠模型中，CEFFE技術(shù)可以顯著降低脂肪的吸收率，除了促血管新生的作用機(jī)理之外，CEFFE還可以通過抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)干細(xì)胞增殖等機(jī)制發(fā)揮作用[22]。

2.3 皮膚光老化

體外試驗(yàn)中，CEFFE可以促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增殖與膠原的合成；裸鼠皮下注射可使真皮內(nèi)微血管數(shù)量增加、真皮層厚度增加[23-24]。在紫外線引起的光老化實(shí)驗(yàn)中，CEFFE可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，抑制紫外線引起的細(xì)胞內(nèi)過氧化物積聚，通過抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、促細(xì)胞增殖與膠原合成、促血管新生等作用，提高真皮組織厚度，抵抗紫外線輻射導(dǎo)致的皮膚老化[25]。

2.4 皮膚擴(kuò)張

皮膚擴(kuò)張技術(shù)是整形外科常用的組織再生技術(shù)，存在擴(kuò)張時(shí)間長(zhǎng)、擴(kuò)張組織回縮等難題。在大鼠皮膚擴(kuò)張模型中，擴(kuò)張區(qū)域局部注射CEFFE可以促進(jìn)血管新生，促進(jìn)真皮組織再生，減少擴(kuò)張過程中的皮膚破潰，降低擴(kuò)張后皮膚的回縮[26]。

2.5 難愈性創(chuàng)面

在糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面修復(fù)模型中，創(chuàng)面局部注射CEFFE可以縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，提高創(chuàng)面愈合率，在負(fù)載凝膠的創(chuàng)面涂抹給藥方式中也獲得了同樣的療效，證實(shí)CEFFE通過促細(xì)胞增殖、促血管新生、調(diào)節(jié)局部炎癥等機(jī)制發(fā)揮作用，促進(jìn)難愈性創(chuàng)面的愈合[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，向脂肪組織中加入PBS后進(jìn)行乳化、離心，所得的下層提取液富含多種生長(zhǎng)因子，能夠有效促進(jìn)小鼠創(chuàng)面愈合，同樣揭示了脂肪組織來源活性因子在創(chuàng)面修復(fù)中的治療作用[29]。

3 應(yīng)用于其他疾病

基于CEFFE所含活性因子與間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的因子相似，推測(cè)其適應(yīng)癥與間充質(zhì)干細(xì)胞的治療適應(yīng)癥可能高度契合。我們針對(duì)在間充質(zhì)干細(xì)胞治療中已取得初步療效的疾病類型，拓展了CEFFE的應(yīng)用方向，證實(shí)了CEFFE在呼吸系統(tǒng)疾病(肺纖維化、呼吸窘迫綜合征)、消化系統(tǒng)疾病(脂肪肝)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(外周神經(jīng)損傷、腦梗死、脊髓損傷)、生殖系統(tǒng)疾病(卵巢早衰、子宮陰道內(nèi)膜萎縮)等動(dòng)物模型中均有顯著的治療效果(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，提示其有望替代間充質(zhì)干細(xì)胞治療部分疾病。

4 CEFFE技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

制備CEFFE的脂肪組織可通過抽脂獲得，抽脂手術(shù)對(duì)機(jī)體的創(chuàng)傷小，另外脂肪組織的抽取對(duì)機(jī)體的不良影響少，大部分脂肪還可以從塑形減重的抽脂手術(shù)獲得，來源廣泛。與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療相比，其存在明顯的優(yōu)勢(shì)。

4.1 制備過程簡(jiǎn)單

CEFFE制備不涉及外源性化合物，整個(gè)過程僅涉及破碎、離心、過濾等一系列物理操作，所含成分均來源于脂肪組織，確保其成分的安全性，整個(gè)制備可通過一體化的設(shè)備來實(shí)現(xiàn)，成本較低[20]。而干細(xì)胞制備過程中涉及酶消化、細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增等復(fù)雜的過程，降低了安全性，同時(shí)制備需要專業(yè)的技術(shù)人員來實(shí)現(xiàn)，成本昂貴[30]。

4.2 質(zhì)量可控

CEFFE提取后可以通過檢測(cè)其中生長(zhǎng)因子的含量來實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，保存和運(yùn)輸過程無須添加額外的保護(hù)劑，和普通的重組生長(zhǎng)因子一樣，在低溫下就可維持生長(zhǎng)因子的活性。干細(xì)胞的穩(wěn)定性尚難控制，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的分離與體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法[31]。研究表明，不同的人員、試劑、保存方式、運(yùn)輸條件和時(shí)間等均可影響干細(xì)胞的特性，同時(shí)無法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，很難進(jìn)行質(zhì)量控制[32-33]。

4.3 療效穩(wěn)定

干細(xì)胞的療效依賴于移植后細(xì)胞的存活及活性，而其存活依賴于細(xì)胞是否能承受移植區(qū)域的惡劣環(huán)境，包括缺血、缺氧、炎癥等，因此治療效果可能難以預(yù)測(cè)[34-36]。而CEFFE直接通過所含的生長(zhǎng)因子等活性成分發(fā)揮作用，其作用效果是穩(wěn)定和可預(yù)測(cè)的。

4.4 給藥途徑多樣

對(duì)干細(xì)胞靜脈輸注后體內(nèi)分布的研究表明，干細(xì)胞在靜脈給藥的過程中大部分會(huì)分布于肺組織，真正能夠達(dá)到創(chuàng)傷部位的細(xì)胞量較少，因此往往需要采用局部動(dòng)脈給藥的方式以達(dá)到治療效果[37]。CEFFE可以通過靜脈給藥的方式作用于全身組織，也可以通過局部給藥的方式直接作用于損傷部位，給藥途徑多樣，短期內(nèi)可反復(fù)給藥。

4.5 副作用少

干細(xì)胞治療存在細(xì)胞栓塞的風(fēng)險(xiǎn)[38]，而CEFFE制備經(jīng)過濾過處理，不含細(xì)胞等大顆粒成分，靜脈注射無栓塞風(fēng)險(xiǎn)，局部注射也無紅腫、過敏等不良反應(yīng)。

4.6 同種異體使用

目前，同種異體干細(xì)胞移植后的宿主免疫排斥反應(yīng)仍難以避免[30]，而CEFFE中不含活細(xì)胞，理論上不引起免疫排斥，可以實(shí)現(xiàn)同種異體的治療。從不同年齡段和不同部位抽取的脂肪組織中分離獲得的CEFFE，主要活性因子的含量無顯著差異，提示未來可通過捐獻(xiàn)的方式獲得脂肪來源，制備通用型的CEFFE生物制劑，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；膽?yīng)用。

5 CEFFE技術(shù)已開展的臨床研究

基于CEFFE在皮膚組織再生和抗皮膚光老化方面的作用，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院通過倫理委員會(huì)審核，開展了自體來源CEFFE治療眶周細(xì)紋、黑眼圈、萎縮性瘢痕的臨床研究。局部皮下多次注射CEFFE可以減少眶周細(xì)紋，減退色素沉著，改善瘢痕組織質(zhì)地，觀察期內(nèi)癥狀進(jìn)行性改善，療效持續(xù)穩(wěn)定。局部注射自體CEFFE除了與注射相關(guān)的疼痛和短期淤青外，無感染、紅腫、瘙癢、蛻皮、過敏等不良反應(yīng)。

6 總結(jié)

CEFFE原料來源廣泛，制備過程相對(duì)簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，質(zhì)量可控，安全性高，副作用少，治療效果可預(yù)測(cè)，可以同種異體應(yīng)用，通過通用型CEFFE制劑的開發(fā)，有望實(shí)現(xiàn)規(guī)模化的臨床應(yīng)用。CEFFE治療適應(yīng)證廣泛，覆蓋全身各大系統(tǒng)的多種難治性疾病，與現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞治療的疾病類型高度重合，有望克服干細(xì)胞治療存在的諸多瓶頸問題，替代現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞治療，成為全新的無細(xì)胞介導(dǎo)的生物治療技術(shù)。