楊繡榮，王 斌，胡曉夢，王婉怡

(浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316022)

氧化應激(oxidative stress，OS)和抗氧化的平衡調(diào)節(jié)是人體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和正常生理功能的一個基本調(diào)節(jié)體系，亦是人體自我保護、抵御疾病的重要機制之一[1-4]。當受到外源(如環(huán)境有害物質(zhì)、紫外輻射、霧霾等)或內(nèi)源(如肝損傷、腫瘤、炎癥等)有害因素傷害時，機體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和清除失衡，過剩的ROS 攻擊大分子物質(zhì)，導致DNA 突變，促使核酸和蛋白質(zhì)交聯(lián)，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，導致細胞功能喪失，出現(xiàn)OS[5-6]。因此，OS 在肝損傷、糖尿病、腫瘤、心血管疾病等發(fā)生和發(fā)展中扮演了舉足輕重的作用。研究證實細胞膜和線粒體膜上的磷脂層多不飽和脂肪酸在OS 狀態(tài)下會發(fā)生嚴重的脂質(zhì)過氧化反應，造成肝細胞損傷，導致脂肪肝病、肝纖維化、肝硬化和肝癌等疾病的發(fā)生[7]。因此，針對OS 導致肝損傷的作用機制開發(fā)高效的抗氧化藥物可有效預防和治療該類疾病，也逐漸成為海洋藥物的重點研究領(lǐng)域。

OS 狀態(tài)下過剩的ROS 破壞細胞內(nèi)大分子物質(zhì)的生理功能是眾多疾病共同的發(fā)病機制，而機體形成了一套復雜的OS 應答系統(tǒng)誘導合成系列的保護性蛋白，降低所受的損害[8]。Keap1-Nrf2-ARE 通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路，其可調(diào)控II 相解毒酶和抗氧化酶基因的表達，消除或減弱OS 對細胞和器官的損傷[9]。現(xiàn)有研究表明抗氧化肽、植物多酚、萊菔硫烷和齊墩果酸衍生物等可激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，調(diào)控下游靶基因的表達，預防和降低OS 損傷，抵制炎癥反應的發(fā)生[1,3,6]。因此，篩選Keap1-Nrf2-ARE 通路的高效激動劑成為抗氧化藥物的研究熱點。

1 Keap1-Nrf2-ARE 通路及其在氧化應激中的重要作用

核因子NF-E2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)主要在肝、腎、肺、皮膚等代謝性和解毒組織器官中表達，是CNC(cap-‘n’-collar)家族中調(diào)節(jié)氧化應激反應的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，其含有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，與胞漿蛋白伴侶分子Keap1(Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1)及抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)共同構(gòu)成Keap1-Nrf2-ARE 通路，在參與細胞抗OS 和外源性有毒物質(zhì)誘導的主要防御機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與肝損傷、衰老、癌癥等疾病聯(lián)系密切[8-9]。

II 相解毒酶或抗氧化基因的誘導、激活是機體對氧化損傷和親電子損傷細胞防御的重要部分，可將有害物質(zhì)在破壞DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子前清除出細胞。在正常生理狀態(tài)下，Nrf2 通過N 端與Keap1 特異性結(jié)合于細胞質(zhì)中處于受抑制狀態(tài)，細胞內(nèi)II 相解毒酶類和抗氧化物處于基礎(chǔ)表達水平。當受到ROS 或其他親電試劑刺激時，Nrf2 與Keap1 解偶聯(lián)轉(zhuǎn)移進入細胞核并與小Maf 蛋白結(jié)合成異二聚體，進而識別并結(jié)合抗氧化反應元件ARE，啟動下游II 相解毒酶和抗氧化酶(NQO1、GST、SOD、γ-GCS、HO-1 等)等基因的轉(zhuǎn)錄、表達，保護機體和細胞免受OS 產(chǎn)生的過剩ROS 及有害物質(zhì)的侵害[10-11]。

因此，Keap1-Nrf2-ARE 通路對II 相解毒酶和抗氧化酶的誘導、表達起到?jīng)Q定性作用，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路。

2 Keap1-Nrf2-ARE 通路激動劑的研究進展

Keap1-Nrf2-ARE 通路在保護細胞和器官免受OS 損傷方面起到了決定性作用，而其激動劑的研究也成為開發(fā)預防和治療OS 相關(guān)疾病藥物的焦點。研究表明Nrf2 的活化主要有2 種方式：(1)作用于Keap1 上的氨酸殘基，如Cys-151 和Tyr-141，誘導Nrf2 從Keap1 中釋放，或者阻止Nrf2 與Keap1 結(jié)合；(2)激活磷酸化信號傳導通路，促使Nrf2 磷酸化而與Keap1 解離，進而增加細胞核內(nèi)Nrf2 的水平[12]。

2.1 肽類激動劑的研究

Keap1-Nrf2-ARE 通路中，Nrf2 與Keap1 結(jié)合時Nrf2 處于受抑制狀態(tài)。因此，根據(jù)Nrf2 與Keap1 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列設(shè)計肽類化合物，將可能得到與Keap1 具有較強結(jié)合力的活性肽，可作為Nrf2 與Keap1 結(jié)合抑制劑(PPI)，提高核內(nèi)Nrf2 的水平而發(fā)揮其生理功能[13]。TU Jingyi,et al[14]研究表明Nrf2 肽(DEETGE-CAL-Tat)可以顯著地降低Nrf2 與Keap1 的結(jié)合力，促進Nrf2 進入細胞核啟動下游控制的細胞保護基因的表達，減輕機體所受OS 的傷害。ABED,et al[10]利用表面等離子體共振(SPR)和熒光偏振(FP)試驗測定了系列Nrf2 肽的Kd 值和IC50值，結(jié)果表明9 mer Nrf2 肽(H-LDEETGEFL)的Kd 值為352 nmol·L-1，IC50值為3.48 μmol·L-1，顯示出與Keap1 最強的結(jié)合能力。在此基礎(chǔ)上，ABED 對16mer Nrf2 肽(AFFAQLQLDEETGEFL-OH) 與Keap1 的結(jié)合方式進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Keap1 上6 個氨基酸殘基(Ser363、Asn382、Arg380、Arg415、Arg483 和Ser508)的側(cè)鏈與16mer Nrf2 上Glu79 和Glu82 的羰基形成氫鍵，結(jié)合于Keap1 的頂部，表明根據(jù)Nrf2 的結(jié)合域設(shè)計兩者之間結(jié)合抑制劑可以阻斷Nrf2 與Keap1 的結(jié)合，促進Nrf2 作用的發(fā)揮。另外，ZHAO Huihui,et al[15]研究表明膠原肽對H2O2誘導的人肝細胞系HL7702 的氧化損傷有保護作用，其可以及時清除細胞內(nèi)的ROS，增加Nrf2 的表達水平，提高SOD、CAT 的活性，減輕脂質(zhì)過氧化反應，消除和減弱OS 所致人的正常肝細胞損傷。

2.2 其他小分子激動劑的研究

除活性肽外，植物多酚等化合物也是Keap1-Nrf2-ARE 通路激動劑研究的焦點。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶多酚中的主要抗氧化活性成分，其通過2 種方式激活Nrf2 通路：(1)EGCG 與谷胱甘肽(GSH)結(jié)合降低細胞內(nèi)GSH 水平，導致上游激酶P13K、PKC、JNK 和ERK 的激活，促使Nrf2 磷酸化。(2)EGCG 的電子形式直接與Keap1 上Cys 殘基相互作用，誘導Nrf2 解離[16]。萊菔硫烷(SFN)是綠花椰菜中的一種間接的抗氧化劑，其通過激活Keap1-Nrf2-ARE 通路誘導多種細胞保護蛋白(GR、HO-1 等)的合成抵御OS 對細胞的損傷[17]。KERNS,et al[18]實驗發(fā)現(xiàn)：SFN 可直接活化JNK 激酶，并通過降低GSH 水平激活p38，進而激活轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1，最終導致角蛋白17 基因轉(zhuǎn)錄；另外，SFN 還可以通過降解胞質(zhì)中Nrf2與Keap1 的結(jié)合物而直接刺激Nrf2 的活性。KLESZCZY■SKI,et al[19]實驗發(fā)現(xiàn)SFN 能增加HaCaT 細胞中Nrf2 活性及Nrf2 依賴性基因(γGCS、HO-1、NQO1)的表達。姜黃素通過對Keap1 上的Cys151 親電修飾來解離Nrf2-Keap1 復合體，激活Nrf2 的表達，進而誘導GSH 生物合成基因Gclc 和Gclm 的mRNA 來提高GSH 的水平[20]。另外，白黎蘆醇、叔丁基對苯二酚、巴多索隆和齊墩果酸衍生物等亦可激動Keap1-Nrf2-ARE 通路，啟動Nrf2 依賴的基因表達，在OS 狀態(tài)下保護細胞和器官[21]。

因此，以Keap1-Nrf2-ARE 通路為靶點，針對性篩選和設(shè)計該通路的高效激動劑，將極大提高OS 相關(guān)疾病治療藥物開發(fā)的成功率。

3 Keap1-Nrf2-ARE 通路參與肝臟疾病病理機制研究

線粒體呼吸鏈復合體利用電子傳遞生產(chǎn)ATP，是ROS 的主要來源，而肝臟富含線粒體成為最易受ROS 攻擊的器官。因此，OS 是引起肝臟病變的主要機制之一，并貫穿肝病的始終。Keap1-Nrf2-ARE 通路抗肝臟損傷涉及調(diào)節(jié)肝臟的代謝和解毒等環(huán)節(jié)，在肝臟疾病的治療和預防中發(fā)揮重要作用[22]。

3.1 對肝代謝酶表達和炎癥的調(diào)節(jié)作用

肝代謝酶的解毒過程中II 相解毒酶催化有活性的I 相代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為更具親水性和穩(wěn)定性的產(chǎn)物，并在III 相代謝排出體外。Nrf2 通過ARE 序列協(xié)同調(diào)節(jié)系列II 相解毒酶基因和III 相代謝酶中載體的表達，加速毒物的轉(zhuǎn)化和排出[23-24]。另外，Nrf2 通過對炎癥細胞因子的調(diào)控，減弱細胞的炎癥反應和氧化損傷[25]。

3.2 對脂肪肝的保護作用

在高脂肪及酒精環(huán)境下，過剩ROS 加速肝臟的損傷，引起脂肪性肝炎，肝纖維化和肝硬化等病癥[9]。Nrf2 信號傳導通路通過加強抗氧化物和解毒酶基因的表達，保護肝細胞免受脂質(zhì)過氧化的損傷；同時Nrf2作用于肝內(nèi)Fas、Fgf21 和CD36 的基因表達，減少脂肪酸從脂肪組織中的釋放和肝對脂肪酸的攝取[26]。

3.3 對藥物性肝損傷的保護作用

某些藥物在肝細胞內(nèi)經(jīng)細胞色素P4502E1 代謝產(chǎn)生過量的ROS 等有害物質(zhì)，進而破壞線粒體膜完整性和膜Ca2+-ATP 酶系[9]。乙酰氨基酚(APAP)介導的肝損害模型研究表明：Nrf2 通過誘導UGT1A6 表達加快APAP 的排泄；另外，APAP 在非毒性劑量下可激活Nrf2，促進GSH 的從頭合成，從而產(chǎn)生的GSH 與APAP活性代謝產(chǎn)物結(jié)合并增加其排出，減弱APAP 毒性[27-28]。

3.4 對肝癌的預防作用

肝癌是導致癌癥死亡的第三大原因。化學致癌物在體內(nèi)經(jīng)I 相代謝酶催化后形成具親電子活性的致癌物，進而引起癌基因和抑癌基因的改變。因此，Nrf2 激動劑如蘋果多酚和萊菔硫烷等可有效激動Keap1-Nrf2-ARE 通路，調(diào)節(jié)II 相解毒酶和抗氧化酶的解毒作用，阻斷或逆轉(zhuǎn)癌癥發(fā)生[29-31]。

3.5 對肝纖維化與肝硬化的作用

肝纖維化的核心問題是ROS 促進肝星狀細胞(HSC)激活并轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞，以及胞外基質(zhì)合成增多而降解不足，是進一步向肝硬化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[9,32]。最新研究顯示，Keap1-Nrf2-ARE 信號通路通過促進GCLC、GSTA2 和NQO1 等解毒酶的表達，加速清除肝細胞中的ROS，抑制HSC 的活化，阻斷肝纖維化的進程[33]。

4 結(jié)論

基于Keap1-Nrf2-ARE 通路參與肝臟疾病病理機制，Nrf2 激動劑已被應用于體內(nèi)外實驗，結(jié)果證明激動劑通過激活Keap1-Nrf2-ARE 通路促進II 相解毒酶等系列基因的表達，有效對抗疾病引起的組織損傷。因此，Keap1-Nrf2-ARE 通路被認為是開發(fā)保肝護肝藥物的一個重要靶點。