數(shù)字PCR技術(shù)在玉米及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

付海濱李修平林 森付 偉劉二龍張明哲朱鵬宇

(1.沈陽海關(guān)技術(shù)中心,遼寧 沈陽 110016; 2.濟(jì)寧海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心,山東 濟(jì)寧 272200; 3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100029; 4.黃埔海關(guān)技術(shù)中心,廣東 廣州 510730; 5.浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,浙江 杭州 310012)

2019年是轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的種植的第24年,全球轉(zhuǎn)基因作物栽培種植面積發(fā)展很快,截止2019年全球轉(zhuǎn)基因作物栽培面積約1.904億hm2,比1996年增長了約112倍,在過去23年(1996～2018年)中,累計種植面積達(dá)27億hm2,轉(zhuǎn)基因作物為全球帶來的經(jīng)濟(jì)效益達(dá)2 249億美元。目前,玉米是獲批轉(zhuǎn)化體數(shù)量最多的農(nóng)作物(已有35個國家/地區(qū)批準(zhǔn)了146個轉(zhuǎn)化體),僅2019年全球種植的轉(zhuǎn)基因作物中就有6 090萬hm2種植了轉(zhuǎn)基因玉米;按單種作物的種植面積計算,2019年全球31%的種植玉米是轉(zhuǎn)基因玉米。轉(zhuǎn)基因玉米種植面積美國最大,2019年美國種植轉(zhuǎn)基因玉米達(dá)3 317萬hm2,巴西位居第二,種植轉(zhuǎn)基因玉米1 630萬hm2,阿根廷位居第三,種植轉(zhuǎn)基因玉米590萬hm2[1]。雖然我國批準(zhǔn)了進(jìn)口轉(zhuǎn)基因玉米用于飼料加工,但目前仍未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因玉米的種植[2]。然而,隨著全球轉(zhuǎn)基因作物栽培面積的不斷增長,轉(zhuǎn)基因作物帶來了人們對其生態(tài)環(huán)境和食品安全問題的擔(dān)憂。目前,很多國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識管理并設(shè)定了轉(zhuǎn)基因含量閥值,如歐盟設(shè)定食品和飼料中轉(zhuǎn)基因成分閥值為0.9%[3],澳大利亞、新西蘭、以色列等國家設(shè)定的閥值為1%,智利的閥值是2%,韓國、馬來西亞設(shè)定的閥值為3%,日本、泰國、印尼等國家設(shè)定的閥值為5%[4～6]。我國高度重視轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的安全問題,目前我國對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管要求最嚴(yán)格,實行“零容忍”?；陂y值的要求,可靠、穩(wěn)定、精確的轉(zhuǎn)基因定量檢測技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法研究的熱點,是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全監(jiān)管和標(biāo)識管理的重要技術(shù)支撐。

目前對玉米及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分檢測方法主要有兩類,一類是基于外源核酸的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù),包括PCR電泳法、多重PCR法、實時熒光PCR法、等溫擴(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)、數(shù)字PCR等;一類是以特定的表達(dá)蛋白為目標(biāo)物的檢測方法,包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、SDS聚丙烯凝膠電泳分析技術(shù)、蛋白質(zhì)氨基酸序列飛行時間質(zhì)譜分析方法、蛋白芯片技術(shù)等[6～7],基于核酸序列的PCR檢測方法是目前食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測的主要技術(shù)。

數(shù)字PCR技術(shù)是繼常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR之后,近年來迅速發(fā)展起來的一種全新的核酸檢測定量分析技術(shù)[8～9]。和熒光定量PCR相比,數(shù)字PCR不依賴擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以實現(xiàn)絕對定量分析,且定量結(jié)果不受PCR擴(kuò)增效率影響,準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好,因此,數(shù)字PCR具有比普通PCR和實時熒光PCR定量技術(shù)無法比擬的優(yōu)越性,在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景[10～13]。目前,數(shù)字PCR技術(shù)已應(yīng)用到玉米及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分定量檢測中[14～15]。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的基本原理

數(shù)字PCR (digital PCR,dPCR)的概念是1999年由Vogelstein等提出的[16],數(shù)字PCR技術(shù)是一種基于泊松分布原理的針對單分子目標(biāo)DNA的絕對定量技術(shù)[17],dPCR不需要對每個循環(huán)進(jìn)行實時熒光測定,也不需要Ct值來定量靶標(biāo)。dPCR先是將樣品大量稀釋等量均分到相互隔離的大量微小的反應(yīng)單元中,每個反應(yīng)單元作為一個獨立的PCR反應(yīng)器,其中含有或不含待檢靶標(biāo)分子(DNA或RNA),在PCR擴(kuò)增結(jié)束之后,在熒光下顯示熒光(含待測核酸分子,表示為“1”),或沒有熒光(不含待測核酸分子,表示為“0”),最后根據(jù)泊松分布原理計算待檢靶標(biāo)分子的濃度或拷貝數(shù)(圖1)。目前,商業(yè)化的數(shù)字PCR儀可以分為兩大類:一是基于微流控芯片數(shù)字PCR儀,二是基于油包水技術(shù)的微滴數(shù)字PCR平臺。

2 數(shù)字PCR技術(shù)在玉米及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分檢測中的應(yīng)用

近年來,很多學(xué)者利用不同的數(shù)字PCR技術(shù)平臺,開展了玉米及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)研究。Corbisier等(2010)最先將數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測中,分析了轉(zhuǎn)基因玉米種子MON810品系中外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)比,分析結(jié)果與以質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熒光定量PCR檢測結(jié)果一致,證實了數(shù)字PCR技術(shù)的可靠性[18]。Dobnik等(2015)建立了轉(zhuǎn)基因玉米微滴數(shù)字PCR多重定量檢測方法,完成了對DAS1507、DAS59122等多個轉(zhuǎn)基因玉米品系的多重定量檢測分析,該方法可滿足國際標(biāo)準(zhǔn)中對轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的要求[19]。Fu等基于篩選元件的無預(yù)處理dPCR檢測方法,以CaMV35s啟動子和NOS終止子作為篩選元件,用微滴數(shù)字PCR和微孔數(shù)字PCR對轉(zhuǎn)基因玉米品系MON810、MON863、TC 1507、MIR604、MIR162等進(jìn)行定量檢測,建立了拷貝數(shù)含量和質(zhì)量含量的線性關(guān)系,并對結(jié)果的重復(fù)性進(jìn)行了實驗室內(nèi)和實驗室間的評估,結(jié)果表明,在無預(yù)處理的情況下,2種數(shù)字PCR檢出限均達(dá)到0.1%, CaMV35s和NOS元件在轉(zhuǎn)基因作物的出現(xiàn)概率分別為65.7%和53.49%,組合后可覆蓋81.4%的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物,即該方法可覆蓋大多數(shù)轉(zhuǎn)基因作物[14]。Zhu等也使用相同的方法,用雙重數(shù)字PCR開展7種轉(zhuǎn)基因玉米品系的檢測[20]。潘廣等(2016)通過建立的轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21二重數(shù)字PCR方法測定了不同質(zhì)量含量的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)百分含量[21]。潘廣等(2016)基于微滴式數(shù)字PCR平臺研究建立了一種在同一個微滴反應(yīng)體系中同時測定轉(zhuǎn)基因玉米品系T25中兩種靶序列的雙重微滴式數(shù)字PCR定量方法,靈敏度實驗結(jié)果表明,在定量結(jié)果精度保持在RSD≤25%時可以檢測到4.6個T25特異性邊界序列分子[15]。胡佳瑩等(2016)基于QuantStudioTM 3D 數(shù)字PCR平臺,建立了轉(zhuǎn)基因玉米MON863品系的單重和雙重數(shù)字PCR定量分析方法,并與傳統(tǒng)的qRT PCR結(jié)果進(jìn)行了比較,結(jié)果表明,相比qRT-PCR,數(shù)字PCR能夠?qū)崿F(xiàn)真正意義上的絕對定量,更加適合用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的含量分析[22]。姜志軍等(2016)利用微滴數(shù)字PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米種外源基因G23V-EPSPS拷貝數(shù)進(jìn)行了檢測分析,證實ddPCR具有較高的靈敏度和精確性[23]。王犇等(2017)建立了微滴式數(shù)字PCR檢測方法,并分析了整合到轉(zhuǎn)基因玉米中的外源基因(EPSP)的拷貝數(shù),該方法與實時熒光定量PCR檢測方法的結(jié)果一致[24]。張佳玲等(2017)利用建立了轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5二重微滴式數(shù)字PCR定量檢測方法,在定量結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于25%時,可定量5個copies的該品系特異性序列分子和4個 copies的內(nèi)源基因分子;而在50 ng模板DNA以下,PCR反應(yīng)模板量與測定樣品拷貝數(shù)之間呈高度正相關(guān),相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.99以上,平均誤差小于10%[25]。周圓等(2018)基于微滴式數(shù)字PCR平臺,建立了TC1507、MIR162、MIR604轉(zhuǎn)基因玉米品系的二重微滴式數(shù)字PCR檢測方法,定量限可達(dá)10 pg或2～16 copies目標(biāo)序列[26]。梁文等(2019)利用微滴數(shù)字PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034、MON810、MIR162設(shè)計引物探針進(jìn)行dPCR定量檢測,通過多對引物探針組合,并篩選最優(yōu)引物探針濃度、退火溫度、PCR反應(yīng)過程的時間、溫度等,建立一套完整的轉(zhuǎn)基因玉米dPCR定量檢測方法,該方法的定量限為0.1%,轉(zhuǎn)基因定量檢測范圍覆蓋0.1%～100%,線性系數(shù)為0.999,精密度優(yōu)于10%,該方法可以同時應(yīng)用到市面上最常用微滴dPCR平臺和3D芯片dPCR平臺,且兩種方法定量結(jié)果一致性好,該方法快速高效,在檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)的qPCR[27]。馬麗俠等(2020)利用轉(zhuǎn)基因玉米MON863質(zhì)粒DNA建立了轉(zhuǎn)基因玉米MON863質(zhì)粒DNA雙重微滴式數(shù)字PCR( ddPCR)的定值方法,優(yōu)化了引物探針濃度,退火溫度等條件,結(jié)果表明,外源基因MON863在1.6～6743.3 copies和內(nèi)源基因Adh在1.1～6770 copies的濃度范圍均呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2為1;MON863基因和Adh基因的定量限分別為8.3 copies和7.9 copies;方法精密度小于5%,采用該方法對基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行驗證,誤差小于10%,該方法每個反應(yīng)體系都含有內(nèi)源(VIC)和外源(FAM)基因,能實現(xiàn)內(nèi)外源基因的同時檢測,避免同一樣品在不同反應(yīng)體系造成的定值差異[28]。梁美丹等(2020)基于雙重微滴數(shù)字PCR平臺建立轉(zhuǎn)基因玉米Bt11品系及內(nèi)源基因定量檢測方法,結(jié)果表明,單位體系內(nèi)源和外源基因拷貝數(shù)在DNA濃度為0.05～10 ng/μl時呈現(xiàn)良好的線性,相關(guān)系數(shù)R2為0.999;內(nèi)源和外源基因的定量低限分別為11.14和3.96 copies,定量準(zhǔn)確度試驗結(jié)果顯示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.68%～10.31%之間,滿足小于25%的要求[29]。楊鎮(zhèn)州等(2020)針對基于RNAi技術(shù)的轉(zhuǎn)基因玉米品系DBN11061,研究并建立了一套逆轉(zhuǎn)錄芯片式數(shù)字PCR (dPCR)定量檢側(cè)該品系玉米雙鏈RNA的方法,該方法的絕對定量限為2.5 copies/μl,RSD為12.4%;檢側(cè)低濃度實際樣品達(dá)21.7 copies/μl,相對偏差為2.7%,RSD為14.6%,滿足國際上轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果RSD小于25%的要求[30]。

我國在利用數(shù)字PCR技術(shù)開展轉(zhuǎn)基因成分定量檢測方面取得了突出成果,已制定了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品數(shù)字PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn),目前有2項國家標(biāo)準(zhǔn)和2項出人境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)頒布,可以指導(dǎo)玉米及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的數(shù)字PCR定量檢測。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 33526-2017《轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品數(shù)字PCR檢測方法》針對玉米、大豆等轉(zhuǎn)基因植物的通用篩選原件CaMV35s啟動子和NOS終止子建立了數(shù)字PCR檢測方法,定量檢測限為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))[31]。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 38132-2019《轉(zhuǎn)基因植物品系定量檢測數(shù)字PCR法》,該標(biāo)準(zhǔn)可采用微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系定量檢測物理加工種子樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MON810、MON89034、 MIR162,定量檢測限為0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))[32]。出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T4993-2017《轉(zhuǎn)基因玉米檢測 微滴式數(shù)字PCR定量法》則覆蓋了對15種轉(zhuǎn)基因玉米品系的檢測,對30 ng玉米基因組DNA的檢測低限為0.1%,150 ng玉米基因組DNA的檢測低限為0.02%[33]。出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 5334.3-2020《轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的數(shù)字PCR檢測方法 第3部分:轉(zhuǎn)基因玉米》對轉(zhuǎn)基因玉米及其產(chǎn)品的數(shù)字PCR定量檢測方法做了更為全面的規(guī)范[34]。

3 問題與展望

我國轉(zhuǎn)基因玉米受限于政策原因,雖然目前在國內(nèi)還沒有放開種植,但我國每年進(jìn)口大量的轉(zhuǎn)基因玉米用于飼料生產(chǎn)加工。轉(zhuǎn)基因玉米及其產(chǎn)品的安全是關(guān)系糧食安全和食品安全的重要問題,因此,各國政府都十分重視轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管和檢測,為此,世界各國紛紛加強轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速、高靈敏度、精準(zhǔn)檢測技術(shù)研究。近幾年,數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)展迅猛,目前市場上Bio-Rad、ThermoFisher等廠家相繼推出技術(shù)較為成熟的數(shù)字PCR產(chǎn)品,主要有Bio-rad公司的QX100和QX200微滴式dPCR系統(tǒng)、ThermoFisher公司的QuantStudioTm 3D dPCR系統(tǒng)、中國銳訊生物公司DropX-2000、小海龜BioDigital以及法國StillaTechnologies公司等,但目前數(shù)字PCR儀及其配套耗材的價格比較昂貴,限制了其廣泛的推廣,同時需要進(jìn)一步制定并形成一批轉(zhuǎn)基因成分?jǐn)?shù)字PCR檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),在我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管實驗室推廣應(yīng)用。今后,高通量、自動化、微型化、低成本、高靈敏度、高特異性、精準(zhǔn)高效的轉(zhuǎn)基因數(shù)字PCR定量檢測技術(shù)成為轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)研究與應(yīng)用的發(fā)展方向。