張文璇 曲庭偉 方 程 金 鑫，2* 嚴(yán)昌國

1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133000；2.東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心/延邊大學(xué)，吉林延吉133002；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，吉林延吉133000

氣腫疽梭菌是屬于細(xì)菌綱，芽孢桿菌科，梭菌屬的一種專性厭氧菌[1]，無莢膜，有鞭毛，在體內(nèi)外均可形成芽孢，且芽孢可長期在土壤中生存，在自然界中分布廣泛[2]。因其基因組與其他梭狀芽孢桿菌相比較小，所以氣腫疽梭菌一度被認(rèn)為只感染反芻動(dòng)物，一般是反芻動(dòng)物食用被污染的飼草或水源，通過消化道創(chuàng)傷侵入機(jī)體，或經(jīng)由機(jī)體深部外傷感染侵入。但在2007年，有報(bào)道顯示該菌也可以導(dǎo)致人類氣性壞疽[3]，嚴(yán)重情況可致死亡，該消息迅速引起眾多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行深入研究。

經(jīng)研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)氣腫疽梭菌的4 種主要抗原和毒力因子在氣腫疽發(fā)病過程中起著重要的作用，分別為細(xì)胞毒素A（CctA）、鞭毛蛋白（flagella）、神經(jīng)氨酸酶（NanA）和透明質(zhì)酸酶（nagH）。本文將主要對(duì)以上4 種抗原的相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)概述，期望能為日后氣腫疽檢測方法和新型疫苗的研究提供參考。

1 細(xì)胞毒素A

細(xì)胞毒素A（CctA）是一種由Joachim Frey 及其團(tuán)隊(duì)經(jīng)全基因序列分析發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)毒素，其分子質(zhì)量為33 ku，屬于細(xì)菌毒素殺白細(xì)胞素超家族β-微孔形成毒素[4]，主要起到細(xì)胞毒性和溶血活性的作用。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，細(xì)胞毒素A 與毒素β、毒素NetB 也有較近的親緣關(guān)系，可以認(rèn)為是梭狀芽孢桿菌旁支出來的新亞科毒素[5-6]。

陳曉潔等[7]對(duì)其進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白無跨膜區(qū)，有信號(hào)肽存在，并預(yù)測該蛋白有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可能含有較多抗原表位，為找到其致病的分子機(jī)理提供了一定依據(jù)。

云巾宴等[8]建立了用于臨床診斷的以氣腫疽細(xì)菌毒素CctA 基因?yàn)榛A(chǔ)的氣腫疽聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法，是目前比較快速、高效的檢測方法[9]。并在后續(xù)試驗(yàn)[2]中對(duì)幾種氣腫疽PCR 檢測方法進(jìn)行了比較，最終發(fā)現(xiàn)以CctA 為靶基因設(shè)計(jì)的引物最為敏感，其最小檢測DNA 量為1.230×10-5pg/μL，為氣腫疽病臨床診斷提供了可靠技術(shù)手段。

張皓等[10]成功擴(kuò)增了CctA 基因目的片段，并獲得了與預(yù)期大小相符的重組質(zhì)粒pMD19-T-CctA和真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-CctA。齊強(qiáng)[11]成功構(gòu)建了能有效刺激小鼠的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答的牛氣腫疽CctA 基因核酸疫苗，在一定程度上增加了機(jī)體細(xì)胞免疫水平，為牛氣腫疽基因CctA 核酸疫苗及免疫策略的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

2 鞭毛蛋白

鞭毛蛋白（flagella）分子質(zhì)量為46 ku[12]，是氣腫疽梭菌的一種重要抗原，也是引起氣腫疽發(fā)病和生物體感染的最重要的毒力因子之一。鞭毛的作用主要是幫助菌體運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)感染在機(jī)體內(nèi)的進(jìn)一步擴(kuò)散。

早在1994年，Mayumi 等[13]就發(fā)現(xiàn)氣腫疽梭菌的鞭毛至少有3 個(gè)抗原決定簇。張永佳等[14]進(jìn)行了氣腫疽延邊株FliA 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建，綜合Mattar 等[15]通過建立小鼠模型進(jìn)行的研究，可知該基因在病原學(xué)檢測和免疫學(xué)方面具有重要的意義[16]。另有試驗(yàn)[17]成功構(gòu)建了重組克隆載體pMDl8-T FliA(c)，但需要注意的是，該方法構(gòu)建克隆載體時(shí)，目的片段擴(kuò)增時(shí)退火溫度的篩選以及目的基因與pMDl8-T 連接的成功率仍不夠理想[17]，進(jìn)行下一步研究時(shí)可以考慮更換更為適合的PCR 方法，或者尋找更合適的載體。

3 唾液酸酶

唾液酸酶（NanA）也稱神經(jīng)氨酸酶，分子質(zhì)量約為81 ku，是主要的毒力基因。經(jīng)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析可知：有2 個(gè)凝血因子活力區(qū)[18]；有1 個(gè)唾液酸酶活力的糖苷水解酶家族[19]，4 個(gè)糖苷水解酶活力區(qū)；有1個(gè)類似半乳糖結(jié)合位點(diǎn)及刀豆蛋白樣葡萄糖酶凝集素[20]。有研究顯示[21]唾液酸酶能夠水解寡糖、糖醛酸苷、糖蛋白和糖脂中的末端唾液酸殘基和甘氨酸殘基，從而影響細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)[22]并能夠破壞宿主免疫調(diào)節(jié)的通路[23-24]。

2011年，Vilei 等[25]在氣腫疽的培養(yǎng)物中提取到了唾液酸酶。根據(jù)綠膿桿菌產(chǎn)生唾液酸酶幫助其在呼吸道上定殖的相關(guān)研究結(jié)果，有理由推測唾液酸酶在細(xì)菌感染和定殖過程中起到了重要作用。且氣腫疽之所以具有發(fā)病迅速，病程短的特點(diǎn)，也很可能是因?yàn)橥僖核崦傅淖饔肹26]。2019年，馬玉騰等[27]對(duì)該基因進(jìn)行了真核表達(dá)載體的構(gòu)建，同年張皓[23]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了小鼠免疫試驗(yàn)，結(jié)果顯示該核酸疫苗能夠明顯使小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，為該病的防控提供了新思路。

4 透明質(zhì)酸酶

透明質(zhì)酸酶是幫助細(xì)菌傳播的重要毒力因子，可以分解透明質(zhì)酸，幫助病原體從最初感染的部位移動(dòng)到目標(biāo)器官[28]。Frey 等[29]的研究發(fā)現(xiàn)了氣腫疽梭菌的基因組有2 種不同的透明質(zhì)酸酶基因，分別為nagH和nagJ，并證實(shí)了nagH的免疫活性。通過對(duì)透明質(zhì)酸酶的克隆和序列分析得出，透明質(zhì)酸酶參與了細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)和連接組織的分解，加快了氣腫疽梭菌及其代謝物質(zhì)在受感染宿主機(jī)體內(nèi)的傳播?？傮w來說，目前對(duì)于氣腫疽梭菌透明質(zhì)酸酶的研究相對(duì)較少。