分子標(biāo)記在連翹種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用

昌秦湘，王曉芳，閆 釗，楊忠義，紀(jì) 薇

（1.太原學(xué)院園林科學(xué)研究所，山西太原 030012；2.太原學(xué)院藝術(shù)設(shè)計(jì)系，山西太原 030012；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷 030801）

連翹（Forsythia suspensa）為木犀科連翹屬的落葉灌木，花金黃色、先葉開放，花期為3—4 月，單花期可持續(xù)20 d 以上且耐修剪[1-2]；連翹果殼為重要的中藥材，分為“青翹”和“老翹”2 種[3]，果實(shí)、根皮也可入藥。我國(guó)野生連翹資源分布廣泛，除華南地區(qū)外，其他地區(qū)均有種植[4]，尤其以延安、漢中、洛陽、臨汾、五臺(tái)、隴南、天水等秦嶺山脈中東部山區(qū)自然分布最廣。連翹作為一種兼?zhèn)溆^賞與藥用價(jià)值的樹種，目前在種植栽培技術(shù)[5]、分子生物代謝成分分析[6-7]等方面已開展研究。連翹作為山西重要道地藥材與“十大藥茶”之一，推進(jìn)藥材標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；瘎?shì)在必行。隨著連翹新品種的涌現(xiàn)與育種目標(biāo)的提高，篩選優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的連翹種質(zhì)資源意義重大，對(duì)研發(fā)連翹特異性分子標(biāo)記技術(shù)提出更高的要求。

目前，分子標(biāo)記在連翹種質(zhì)資源及遺傳育種方面應(yīng)用最廣的是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）與簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)（ISSR）。RAPD 是以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)、檢測(cè)DNA 多態(tài)性的第一代分子標(biāo)記[8]；SSR、ISSR 是以PCR 為核心的第二代分子標(biāo)記[9]，相比于RAPD 具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單和重復(fù)性好等特點(diǎn)[10-11]。單核苷酸多態(tài)性（SNP）被認(rèn)為是當(dāng)前最具應(yīng)用前景的分子標(biāo)記，作為第三代分子標(biāo)記比第一、二代分子標(biāo)記工作效率更高，適用于大樣本檢測(cè)[12]。SNP 主要指單個(gè)核苷酸變異導(dǎo)致在基因組水平上的DNA序列多態(tài)性[13]，具有遺傳穩(wěn)定性高、位點(diǎn)豐富、自動(dòng)化分析、二態(tài)性及等位基因性等[14]特點(diǎn)。目前四類分子標(biāo)記已在文冠果[15]、金銀花[16]、蘋果[17]、羽衣甘藍(lán)[18]、皺皮木瓜[19]、梨[20]等物種的品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系等方面有廣泛研究。因此，筆者將從以下幾個(gè)方面綜述分子標(biāo)記在連翹種質(zhì)資源與遺傳育種中的應(yīng)用，以期為連翹遺傳育種研究提供參考。

1 品種鑒定應(yīng)用

連翹因早春花朵繁密、抗逆性強(qiáng)、藥用價(jià)值高等特點(diǎn)，種植范圍擴(kuò)大及新型品種的增多，導(dǎo)致同物異名或異物同名現(xiàn)象普遍，為連翹育種與生產(chǎn)帶來阻力。分子標(biāo)記技術(shù)的研發(fā)有效提高連翹品種鑒定效率，目前RAPD、SSR、ISSR 技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。SHIM等[21]利用RAPD 技術(shù)對(duì)連翹金葉新品種進(jìn)行DNA 指紋圖庫(kù)分析。

SUH 等[22]運(yùn)用RAPD 技術(shù)對(duì)荷蘭、美國(guó)、韓國(guó)三地連翹雜交品種鑒定，發(fā)現(xiàn)由RAPD 標(biāo)記生成的樹狀圖中，分為2 個(gè)簇，其中，CL-I 簇多數(shù)為F.×intermedia 雜交品種（Forsythia suspensa 和Forsythia koreana），CL-II 簇包含F(xiàn)orsythia europaea、Forsythia densiflora、Forsythia mandshurica、Forsythia japonica、Forsythia viridissima、Forsythia ovata 及其衍生物等。顧華等[23]用40 種RAPD 引物對(duì)山西5 個(gè)地區(qū)的11 個(gè)連翹品種區(qū)分開來。張璐[24]用RAPD 技術(shù)設(shè)計(jì)的30 對(duì)引物完成了對(duì)7 個(gè)連翹品種道地性的分類。何苗[25]運(yùn)用SSR 技術(shù)對(duì)貫葉連翹進(jìn)行位點(diǎn)分析，獲得了7 643 個(gè)位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)了貫葉連翹特異性SSR 引物。FU 等[26]使用9 個(gè)微衛(wèi)星（SSR）位點(diǎn)分析20 個(gè)連翹種群的差異，擴(kuò)增出134 個(gè)等位基因來區(qū)分186 個(gè)品種。KIM等[27]選用93 個(gè)ISSR 擴(kuò)增帶對(duì)5 個(gè)種群的連翹品種進(jìn)行鑒定分類。李璐等[28]采用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)連翹25 個(gè)自然種群鑒定，用篩選的13 條引物共擴(kuò)增出353 條清晰條帶，通過清晰條帶上的基因型區(qū)分195 個(gè)品種，為研究連翹種質(zhì)資源與遺傳多樣性提供了參考。

2 遺傳多樣性和親緣關(guān)系的應(yīng)用

遺傳多樣性反映種內(nèi)性狀的差異及對(duì)環(huán)境適應(yīng)、改造的潛力[9，29]。分子標(biāo)記在連翹遺傳多樣性的應(yīng)用，加快了其育種的效率與品種的改良。

2.1 遺傳多樣性研究

李漢偉等[30]運(yùn)用RAPD 研究不同花柱類型連翹遺傳多樣性，為不同產(chǎn)地、花柱類型的連翹構(gòu)建了指紋數(shù)據(jù)庫(kù)。FU 等[31]開發(fā)了第一套連翹微衛(wèi)星標(biāo)記來評(píng)估遺傳多樣性，從100 個(gè)SSR 基因座篩選出70 對(duì)引物，其中，11 個(gè)位點(diǎn)顯示出基因多態(tài)性。同時(shí)，在連翹種群遺傳多樣性參數(shù)中基因座的等位基因平均值為4.2，近交系數(shù)為0.212～0.500，發(fā)現(xiàn)種群中基因型不平衡，存在顯著的等位基因關(guān)聯(lián)。孟令芝[32]從設(shè)計(jì)的76 對(duì)SSR 引物中篩選出11 對(duì)具有多態(tài)性的引物進(jìn)行連翹多樣性檢測(cè)，結(jié)果表明，不同地區(qū)連翹遺傳變異與產(chǎn)地、生長(zhǎng)因子相關(guān)聯(lián)。WANG 等[33]從連翹已檢測(cè)到的3 199 個(gè)SSR 引物位點(diǎn)中，選取40 個(gè)位點(diǎn)研究16 個(gè)地區(qū)連翹的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，32 對(duì)清晰引物擴(kuò)增帶，其中12對(duì)具有多樣性。湯正輝等[34]應(yīng)用ISSR 分析河南連翹6 個(gè)自然種群的遺傳多樣性，結(jié)果顯示不同地區(qū)連翹的遺傳多樣性很高。KIM 等[27]采用ISSR 研究Forsythia ovata Nakai 的遺傳多樣性，平均每個(gè)ISSR 引物擴(kuò)增數(shù)為6.6 個(gè)，該連翹品種的多樣性相對(duì)于其他灌木物種低。姜濤等[35]利用SLAF-seq 技術(shù)獲得1 809 741 個(gè)SNP 分子標(biāo)記，對(duì)39 份連翹種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。LI 等[36]對(duì)中國(guó)15 個(gè)自然種群的連翹進(jìn)行SNP 鑒定，獲得了1 120 232 個(gè)SLAF 基因座，每個(gè)SLAF 基因座的平均測(cè)序深度為11.51×，在這些SLAF 基因座中有1 021 768 個(gè)是多態(tài)的，其中的575 792 個(gè)高質(zhì)量SNP 用于后續(xù)的群體遺傳多樣性分析。

2.2 親緣關(guān)系分析

顧華等[23]運(yùn)用40 個(gè)RAPD 引物研究山西6 個(gè)地區(qū)11 種連翹品系的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，不同區(qū)域的品系可劃分為2 個(gè)基因型，在DNA 水平上差異多樣化。吳婷[37]基于RAPD 擴(kuò)增帶與UPGMA 法，對(duì)14 種連翹藥材進(jìn)行親緣關(guān)系分析，按照不同遺傳相似系數(shù)劃分，得到山西地區(qū)連翹親緣關(guān)系較近且能區(qū)分于其他省份的連翹品種。夏偉[38]采用SSR研究4 種果型、不同產(chǎn)地連翹的親緣關(guān)系，果型分析表明，F(xiàn)C、TY、JFC 較LY 果型的親緣關(guān)系更近，LY 遺傳穩(wěn)定性好，可將其推選為新型品種；地域分析表明，12 個(gè)連翹種群的基因交流比較密切，來源與地理距離無關(guān)。同時(shí)，還利用ISSR 分析了山西、河南省25 個(gè)連翹居群的遺傳變異性與遺傳距離，得出66.82%的變異性存在于居群內(nèi)，遺傳分化明顯，遺傳距離與海拔、地形、壓力等環(huán)境、生態(tài)因子有關(guān)。王琳[39]通過ISSR 擴(kuò)增引物分析不同省份連翹的親緣性，結(jié)果表明，4 個(gè)省份連翹的遺傳相似度在0.982 7～0.990 3，遺傳距離范圍為0.009 7～0.017 5，說明了遺傳相似度很高，尤其是山西與河南之間；遺傳距離的遠(yuǎn)近與地理位置有一定的關(guān)聯(lián)，其中，山西與河北的遺傳距離最遠(yuǎn)。

3 DNA 指紋圖譜的構(gòu)建與關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用

利用分子標(biāo)記構(gòu)建連翹的基因指紋圖譜，可選擇較少的引物，快速高效的鑒別更多的資源。馮帥[40]提取連翹中的DNA 得到ITS2 序列，以此作為DNA條形碼序列來辨別連翹的真?zhèn)巍Ｓ只赑CR-RAPD分子標(biāo)記，建立不同產(chǎn)地連翹的生物指紋圖譜，以便對(duì)連翹與金鐘花進(jìn)行鑒別。吳婷等[41]通過45 條RAPD 引物對(duì)14 批不同產(chǎn)地的連翹進(jìn)行篩選，結(jié)果獲得11 條多態(tài)性指紋位點(diǎn)數(shù)據(jù)，建立了DNA 指紋圖庫(kù)，以便對(duì)不同產(chǎn)地的連翹進(jìn)行鑒別。

連翹自然群體進(jìn)化中受選擇、突變、重組等影響，導(dǎo)致部分等位基因存在非隨機(jī)的關(guān)聯(lián)，可基于分子標(biāo)記技術(shù)分析連翹生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、基因特異性表達(dá)等關(guān)聯(lián)應(yīng)用。付子真[42]結(jié)合微衛(wèi)星位點(diǎn)分析連翹遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連翹的遺傳多樣性低于其他種子植物，其中花粉傳播的基因流是影響連翹種群分化的關(guān)鍵因素，為連翹資源的利用與保護(hù)提供了依據(jù)。SUN 等[43]采用SNP 研究連翹中ENR（恩諾沙星）與耐ENR 菌株基因的差異表達(dá)，結(jié)果顯示，82個(gè)具有突變基因的SNPs 表達(dá)上調(diào)，31 個(gè)SNPs 表達(dá)下調(diào)。WANG 等[44]從連翹中獲取完整的葉綠體基因組，對(duì)檢測(cè)到的54 個(gè)SSR 分析葉綠體基因序列，發(fā)現(xiàn)葉綠體SSRs 大部分由單核苷酸和二核苷酸重復(fù)組成，分別被標(biāo)記35 次和7 次；SSR 可能是特定于譜系標(biāo)記，多數(shù)SSR 位于IGS 和內(nèi)含子中，僅有5 個(gè)位于編碼區(qū)中，為后續(xù)研究連翹進(jìn)化和遺傳多樣性提供了依據(jù)。

4 展望

近年來，4 類分子標(biāo)記在連翹品種鑒別、遺傳多樣性、DNA 指紋圖庫(kù)的構(gòu)建等方面開展了許多的研究，開發(fā)出一些與目標(biāo)性狀相關(guān)的特異性分子標(biāo)記，為連翹種質(zhì)資源的保護(hù)與利用提供了理論依據(jù)。但分子標(biāo)記在連翹方面的應(yīng)用比較局限，如ISSR、SNP 技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用處于起步階段，在連鎖圖譜構(gòu)建、抗逆性QTL 定位及藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)、開花、種子性狀關(guān)聯(lián)分析等方面的應(yīng)用較為缺乏。這也后續(xù)為連翹分子標(biāo)記的應(yīng)用提供廣大的研究空間，可基于新一代分子標(biāo)記技術(shù)建立優(yōu)質(zhì)連翹品種資源庫(kù)、提高標(biāo)記選擇的準(zhǔn)確性和高效性，完善連翹優(yōu)良性狀關(guān)聯(lián)分析與輔助育種等的應(yīng)用。