膜聯(lián)蛋白A1對(duì)器官缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展

張?jiān)?，張紅

(1.遵義市第四人民醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563004；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563000)

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)是指組織或器官經(jīng)過一段時(shí)間的缺血后重新恢復(fù)血供，但因組織器官生理功能未能及時(shí)恢復(fù)，而加重其功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的一種病理狀態(tài)。IRI的發(fā)生有兩個(gè)階段：由血管阻塞所致的缺血階段和隨后的再灌注階段，表現(xiàn)為局部和全身的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)[1]。臨床常見于動(dòng)脈搭橋、心腦肺復(fù)蘇、溶栓療法、斷肢再植及器官移植等?！叭毖笔侵赣捎趧?dòng)脈流入受阻而導(dǎo)致的組織血液供應(yīng)不足，組織細(xì)胞功能障礙的嚴(yán)重程度與受梗阻的程度和持續(xù)時(shí)間有關(guān)，對(duì)器官缺血的治療主要為盡早恢復(fù)受影響器官的血流。然而，再灌注會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，可以誘導(dǎo)和加重組織損傷[2]。近年來，尋找器官IRI的保護(hù)方法成為研究熱點(diǎn)。目前，臨床尚未發(fā)現(xiàn)IRI的特效藥物和方法，原因主要為IRI機(jī)制尚不十分明確。膜聯(lián)蛋白(annexin，Anx)A1是一種天然的內(nèi)源性抗炎蛋白，可干擾粒細(xì)胞的聚集、遷移和在炎癥部位的活性；參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞信號(hào)傳遞等過程[3]，從而減輕器官IRI?，F(xiàn)就AnxA1對(duì)器官IRI保護(hù)作用的研究進(jìn)展予以綜述。

1 AnxA1

Anx是一類鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族，其中AnxA1是最早發(fā)現(xiàn)的成員，也被稱為脂皮素、依鈣蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白或p35。AnxA1由中心結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域[4]組成。其在機(jī)體多數(shù)器官、組織中廣泛存在，在中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞中均高表達(dá)。Ac2-26是來自于AnxA1 N端結(jié)構(gòu)域的活性肽，具有AnxA1的生物學(xué)功能。近年來研究表明，AnxA1參與多種細(xì)胞的病理生理過程，包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷脂酶A2活性的抑制，以及宿主免疫系統(tǒng)中糖皮質(zhì)激素抗炎反應(yīng)的調(diào)節(jié)[5]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)AnxA1對(duì)機(jī)體心臟、腦、肺臟、腎臟及胃腸損傷具有一定的保護(hù)作用。

2 AnxA1對(duì)器官IRI的保護(hù)作用及機(jī)制

2.1心臟IRI 缺血性心臟病是導(dǎo)致死亡的主要原因，心肌缺血時(shí)，由于氧化磷酸化停止導(dǎo)致的ATP消耗可抑制心肌收縮功能。最初，人們認(rèn)為再灌注可以限制梗死面積并維持左心室收縮功能。然而，研究證明再灌注本身可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡[6]。缺血性心臟病中的再灌注導(dǎo)致活性白細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞和其他介質(zhì)，如補(bǔ)體碎片、活性氧類和促炎細(xì)胞因子在缺血組織中大量流出，而這些物質(zhì)會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞死亡和心肌進(jìn)一步損傷[7]，心肌細(xì)胞IRI后，胱天蛋白酶12和胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)增加[8-9]，而缺血導(dǎo)致Ca2+超載，對(duì)心肌超微結(jié)構(gòu)造成損傷。

在心肌IRI小鼠模型中，AnxA1模擬肽Ac2-26不僅可以減少心肌細(xì)胞死亡，而且還可以減輕心肌壞死、炎癥、心肌纖維化和凋亡，對(duì)心肌起到潛在的保護(hù)作用[10]。其機(jī)制可能與Ac2-26減小心肌梗死面積和降低循環(huán)心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物(肌鈣蛋白)水平，延遲心肌梗死后的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有關(guān)[11]。Ac2-26在心肌IRI早期有心臟保護(hù)作用，可限制、延遲早期左心室收縮功能障礙，表明Ac2-26可能是心肌IRI的標(biāo)志物，可能成為缺血性心臟病治療的新靶點(diǎn)。Qin等[12]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性抗炎AnxA1在IRI后維持左心室活力和功能方面起重要作用，但其在體內(nèi)的心臟保護(hù)作用機(jī)制目前尚不清楚。而Ac2-26可通過脂氧素A4/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號(hào)通路減輕心肌病理損傷和心肌超微結(jié)構(gòu)損傷，減少膿毒癥誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心臟有保護(hù)作用。其主要通過上調(diào)脂氧素A4蛋白表達(dá)水平，降低PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平，下調(diào)核因子κB活性，降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，抑制h9c2細(xì)胞胱天蛋白酶3/8的活性來實(shí)現(xiàn)[13]。Perretti等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AnxA1衍生肽CR-AnxA12～48在缺血再灌注誘導(dǎo)的心臟損傷中有顯著的心肌保護(hù)作用。這種被稱為CR-AnxA12～48的肽對(duì)促分解脂蛋白A4受體具有高度的親和力和特異性，能促進(jìn)凋亡中性粒細(xì)胞的有效增殖，減少中性粒細(xì)胞向活化的內(nèi)皮細(xì)胞的募集，從而有效調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞反應(yīng)。

2.2腦IRI 腦血管疾病是繼缺血性心臟病后常見的死亡原因。急性缺血性腦卒中是引起腦血管疾病最常見的原因[15-16]，其治療主要為快速再通閉塞血管，恢復(fù)血液供應(yīng)，限制局部缺血損傷和全身缺氧損傷。然而，再灌注可導(dǎo)致分子水平和細(xì)胞水平的組織損傷，缺血可導(dǎo)致各種細(xì)胞介質(zhì)的堆積，包括活化的白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)和血小板的堆積，同時(shí)缺血可激活常駐細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞)和超氧化物的產(chǎn)生，進(jìn)而刺激細(xì)胞因子[TNF-α和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β]的生成[17-18]。

Gussenhoven等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在未成熟的腦組織中，AnxA1可預(yù)防腦缺血后血腦屏障丟失并改善缺血缺氧后血腦屏障的完整性，對(duì)腦IRI具有保護(hù)作用。在腦血管和腦室管膜誘導(dǎo)缺血缺氧后24 h內(nèi)內(nèi)源性AnxA1缺失，在小膠質(zhì)細(xì)胞中缺血缺氧72 h后AnxA1上調(diào)。其作用機(jī)制主要為AnxA1通過靶向作用于甲酰肽受體(formyl peptide receptor，F(xiàn)PR)發(fā)揮治療作用，而這一治療作用可被FPR抑制劑所消除[20]。Peritore等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在腦IRI過程中，AnxA1模擬肽Ac2-26很大程度上控制了炎癥反應(yīng)，對(duì)腦IRI有保護(hù)作用。有學(xué)者對(duì)小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行閉塞，然后再灌注，并用AnxA1模擬肽Ac2-26治療40 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠白細(xì)胞黏附減少，2 h后所有腦微血管中白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用降低；而對(duì)照小鼠聯(lián)合應(yīng)用Ac2-26和FPR拮抗劑進(jìn)行治療，40 min時(shí)完全消除了Ac2-26的作用，且在應(yīng)用FPR拮抗劑后2 h時(shí)效果較差，這可能因?yàn)锳c2-26對(duì)L-E早期作用更明顯[22]。

Gimenes等[23]研究表明，Ac2-26通過下調(diào)炎癥介質(zhì)和神經(jīng)元丟失發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用。炎癥過程被認(rèn)為是大腦顳葉癲癇病理生理學(xué)的一個(gè)重要機(jī)制，在毛果蕓香堿誘導(dǎo)的大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，Ac2-26的全身治療降低了海馬的神經(jīng)元變性和白蛋白水平[23]。另外，Ac2-26降低了星形細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白的水平，并減少IL-1β、IL-6和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)α蛋白的表達(dá)?？梢姡寡椎鞍譇nxA1是通過抑制白細(xì)胞遷移和促炎介質(zhì)釋放來調(diào)節(jié)腦神經(jīng)炎癥的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

Park等[24]研究發(fā)現(xiàn)，AnxA1通過抑制RhoA-ROCK信號(hào)通路恢復(fù)了β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)1～42誘導(dǎo)的血腦屏障破壞，對(duì)腦有保護(hù)作用。在小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞系彎曲處，AnxA1可減少Aβ1～42引起的血腦屏障破壞[24]。而RhoA抑制劑減輕了Aβ1～42誘導(dǎo)的血腦屏障破壞，RhoA-GTP(RhoA的活性形式)持續(xù)過度表達(dá)減弱了AnxA1的保護(hù)作用。Vital等[25]采用活體顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，腦IRI伴有中性粒細(xì)胞、血小板活化，且中性粒細(xì)胞、血小板在腦微血管內(nèi)聚集。而AnxA1 N端衍生肽Ac2-26可激活中性粒細(xì)胞，調(diào)節(jié)腦內(nèi)中性粒細(xì)胞血小板聚集的形成，抑制腦微血管系統(tǒng)的反應(yīng)，明顯改善缺血后大腦微循環(huán)，對(duì)腦IRI有保護(hù)作用。

2.3肺IRI 體外循環(huán)肺損傷是心外科術(shù)后常見并發(fā)癥之一，學(xué)者認(rèn)為IRI可能是體外循環(huán)肺損傷的重要原因之一[26-27]，IRI可激活中性粒細(xì)胞，并在肺組織內(nèi)聚集、潴留，產(chǎn)生炎癥“級(jí)聯(lián)瀑布”效應(yīng)。而體外循環(huán)肺損傷的發(fā)生機(jī)制及尋找肺保護(hù)措施，一直是體外循環(huán)研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

Liao等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的肺損傷模型中外源性Ac2-26可顯著減輕肺水腫、減少支氣管肺泡灌洗液中促炎細(xì)胞因子的生成、減輕氧化應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡及中性粒細(xì)胞溶解，減少受損肺組織中AnxA1蛋白的表達(dá)，抑制核因子κB和促分裂原活化的蛋白激酶途徑，減輕缺血再灌注引起的肺損傷，對(duì)肺有保護(hù)作用。而用FPR拮抗劑Boc2處理可以消除Ac2-26的保護(hù)作用。在慢性阻塞性肺疾病誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中，腹腔內(nèi)注射Ac2-26對(duì)慢性阻塞性肺疾病誘導(dǎo)的肺損傷有保護(hù)作用[29]。外源性Ac2-26可以防止支氣管肺泡灌洗液、肺部和氣管中的白細(xì)胞增多，其作用的具體機(jī)制為血漿和支氣管肺泡灌洗液中的促炎介質(zhì)減少，抗炎細(xì)胞因子水平升高。IRI后，肺組織、血漿中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高[30]。其中，IL-6被認(rèn)為是嚴(yán)重急性肺損傷的標(biāo)志[31]。

在AnxA1誘導(dǎo)的肺損傷模型中，肺成纖維細(xì)胞中的IL-6、IL-8和IL-1β水平在前6 h升高，后6 h下降。當(dāng)AnxA1刺激的濃度升高和持續(xù)時(shí)間增加時(shí)，AnxA1足以緩解炎癥，減輕炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的膠原沉積，對(duì)肺有保護(hù)作用[32]。AnxA1可提高支氣管上皮細(xì)胞的存活率，對(duì)肺損傷有保護(hù)作用。這種保護(hù)作用機(jī)制可能通過上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，AnxA1通過減少活性氧類的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛和乳酸脫氫酶的活性，可以減輕苯并芘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

此外，AnxA1通過減少Bcl-2的表達(dá)，以及增加Bcl-2相關(guān)X蛋白和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，從而起到肺保護(hù)作用[33]。腸IRI也是急性肺損傷發(fā)生的主要原因，而用外源性Ac2-26治療可以減少肺血管滲漏，降低腸道IRI后肺組織中性粒細(xì)胞和髓過氧化物酶水平，這可能由于Ac2-26可以減少促炎細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生，并促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的釋放，從而起到肺保護(hù)作用[34]。

2.4腎IRI 腎移植是引起腎IRI的主要原因。由于先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的激活，移植腎在再灌注階段會(huì)發(fā)生更嚴(yán)重的損傷，許多接受腎移植患者正在接受免疫抑制治療，以預(yù)防移植功能障礙。環(huán)孢菌素是一種免疫抑制劑，用于避免器官移植排斥反應(yīng)。環(huán)孢菌素治療的主要副作用為腎毒性，其可降低腎血流量，增加腎血管阻力，從而使腎發(fā)生IRI[35]。

研究發(fā)現(xiàn)，Ac2-26外源性給藥可以逆轉(zhuǎn)腎毒性，對(duì)腎有保護(hù)作用[36]。腎IRI的特征為腎小球?yàn)V過率(即單位時(shí)間內(nèi)兩腎生成濾液的量)降低。缺血導(dǎo)致ATP的消耗，進(jìn)而抑制腎小管Na+，K+-ATP酶的活性和Na+/H+交換器的再分布[36]。這兩種情況均會(huì)導(dǎo)致管狀細(xì)胞對(duì)Na+的再吸收減少。由于Na+濾過增加，Na+通過腎小管負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制限制了腎小球?yàn)V過率，以避免Na+和水的流失[37]。腎IRI后腎功能受損，血肌酐、血尿素氮升高，腎臟小管上皮細(xì)胞脫落死亡[38]。Facio等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腎IRI模型中，給予外源性AnxA1模擬肽Ac2-26可減少腎小管壞死、吞噬細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)的流入、Na+和K+排泄以及降低腎小球?yàn)V過率，從而對(duì)腎臟起保護(hù)作用。

糖尿病是一種代謝綜合征，影響許多器官(包括腎臟)，30%～40%的糖尿病患者出現(xiàn)腎病[40]。Purvis等[41]研究發(fā)現(xiàn)，AnxA1可通過減少p38、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和c-Jun氨基端激酶的磷酸化，激活A(yù)kt信號(hào)通路從而減輕糖尿病小鼠微血管并發(fā)癥，對(duì)腎損傷有保護(hù)作用，這表明AnxA1可能是治療腎功能不全的潛在策略。

2.5胃腸IRI 胃腸道系統(tǒng)的IRI主要見于腹部和胸部血管手術(shù)，也可能與小腸移植和出血性休克有關(guān)。大多數(shù)胃腸道并發(fā)癥導(dǎo)致腸系膜缺血和IRI。其中，與腸系膜IRI相關(guān)的死亡率為40%～60%[42]。炎癥是腸道IRI的重要因素。腸道IRI通過核因子κB激活局部炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子(如細(xì)胞因子、細(xì)胞間黏附分子)和趨化因子受體的產(chǎn)生。IRI導(dǎo)致白細(xì)胞的募集和滲透，造成組織損傷[43]。同時(shí)，缺血的腸黏膜也會(huì)產(chǎn)生大量不同的炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，如TNF-α、IL-12、IL-15和IL-23，它們可以顯著增加白細(xì)胞浸潤(rùn)，加劇炎癥和損傷[44]。

研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腸系膜IRI模型中，靜脈注射Ac2-26可抑制白細(xì)胞黏附和遷移，對(duì)腸系膜IRI有保護(hù)作用[45]。上皮細(xì)胞屏障的喪失是腸IRI的主要特征，但目前關(guān)于AnxA1對(duì)腸IRI模型中上皮細(xì)胞屏障影響的研究較少。研究顯示，AnxA1在胃腸道炎癥小鼠模型(包括結(jié)腸炎和胃潰瘍)中起保護(hù)作用[46]。另有研究表明，Ac2-26可促進(jìn)胃黏膜損傷的愈合，減小潰瘍面積，對(duì)胃有保護(hù)作用。Leoni等[47]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用聚合物納米粒在腸道局部輸送Ac2-26時(shí)，可以增強(qiáng)結(jié)腸炎的上皮細(xì)胞修復(fù)，對(duì)腸有保護(hù)作用。在活檢誘導(dǎo)的腸IRI模型中，將外源性AnxA1模擬肽Ac2-26封裝在靶向聚合物納米粒(Ac2-26 Col Ⅳ NP)內(nèi)，局部腸道輸送加速了小鼠結(jié)腸損傷的愈合[47]。此外，Ac2-26 Col Ⅳ NP一次全身給藥可加速實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎后的恢復(fù)。

AnxA1在腸道切口愈合中依賴于FPR1/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，Nox1)的作用[48]，AnxA1與FPR1結(jié)合后，激活SRC和下游Nox1，由Nox1產(chǎn)生的活性氧類導(dǎo)致人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和ptp-pest的快速可逆性氧化，隨后迅速失活。這種失活的磷酸酶參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并導(dǎo)致Fax和Paxillin的局灶性黏附蛋白活化，從而增加上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和切口修復(fù)，對(duì)腸道有保護(hù)作用[49]。在右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，學(xué)者發(fā)現(xiàn)AnxA1可以通過與FPR受體結(jié)合來調(diào)節(jié)腸道黏膜損傷和炎癥反應(yīng)，對(duì)腸道有保護(hù)作用。

3 小 結(jié)

近年來，尋找器官IRI的保護(hù)措施是研究的熱點(diǎn)。AnxA1作為鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白，目前已被證明對(duì)多種器官IRI有一定的保護(hù)作用。AnxA1可干擾粒細(xì)胞的聚集、遷移和在炎癥部位的活性，通過減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，減少器官缺血后再灌注組織損傷，對(duì)器官起到保護(hù)作用，有廣闊的應(yīng)用前景。但AnxA1對(duì)器官IRI方面的保護(hù)作用機(jī)制有待深入研究和闡明。且目前對(duì)AnxA1的研究多停留于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在臨床的推廣使用需進(jìn)一步驗(yàn)證。未來，期望AnxA1的藥理學(xué)研究會(huì)有新進(jìn)展，并將其應(yīng)用于器官IRI的臨床靶向治療。