基于納米材料的電化學(xué)免疫傳感器及其在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的研究進(jìn)展

楊倩雯，劉曉風(fēng)，曾海娟，王金斌

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海 201106；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的檢測(cè)技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物研究、食品及環(huán)境中有毒有害物質(zhì)的分析。蛋白質(zhì)的常規(guī)檢測(cè)方法大體分為兩種：一種是依據(jù)含氮量推算蛋白含量，如凱氏定氮法、杜馬斯定氮法；另一種是以蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)，采用相關(guān)儀器設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)，如分光光度法、甲醛滴定法。然而常規(guī)檢測(cè)技術(shù)普遍存在成本高、耗時(shí)長、靈敏度低、操作復(fù)雜等問題，因此研究者在不斷探索低成本、高靈敏度、操作簡單的新型檢測(cè)方法，來彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)技術(shù)的不足。

目前已有大量研究報(bào)道了蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，其中不乏一些操作快速、簡單的檢測(cè)方法，如毛細(xì)管電泳法、近紅外光譜法、共振瑞利散射光譜法、生物傳感器法等。其中免疫傳感器是目前檢測(cè)蛋白質(zhì)最重要且應(yīng)用最廣的生物傳感方法。與常規(guī)檢測(cè)方法相比，免疫傳感器具有靈敏度高、特異性高、耗時(shí)短、造價(jià)低、易攜帶、操作簡單等多重優(yōu)點(diǎn)[1]。免疫傳感器通過兩個(gè)途徑以提高檢測(cè)物質(zhì)的靈敏性：一是聯(lián)合電化學(xué)分析技術(shù)，如循環(huán)伏安法、差分脈沖法、脈沖伏安法等[2]；二是選用良好的電極修飾材料，通過增加峰電流從而提高傳感器的靈敏度。

隨著納米材料在免疫傳感器中的不斷發(fā)展，研究者們重點(diǎn)集中于研究納米材料的選擇、復(fù)合納米材料的制備以及如何實(shí)現(xiàn)新型納米材料的信號(hào)放大，納米材料在免疫傳感器的應(yīng)用為提高其檢測(cè)靈敏度帶來很大的突破，并使其具有更廣的應(yīng)用前景。本文通過總結(jié)免疫傳感器構(gòu)建原理及目前納米材料在免疫傳感器中的應(yīng)用，匯總免疫傳感器在蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，并對(duì)目前免疫傳感器的不足及未來發(fā)展方向展開討論，以期為蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 電化學(xué)免疫傳感器概述

電化學(xué)免疫傳感器是一種連續(xù)、可逆的感受生物量和化學(xué)量的裝置。電化學(xué)免疫傳感器是利用免疫技術(shù)結(jié)合各種電化學(xué)分析方法的免疫分析法，綜合了電化學(xué)分析技術(shù)的高靈敏性和免疫分析技術(shù)的高選擇性和特異性。其原理是將抗原（抗體）固定在基底電極表面，利用抗體-抗原間的相互作用發(fā)生免疫反應(yīng)，使電極及緩沖液的電性發(fā)生變化，從而轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測(cè)信號(hào)如電流、電勢(shì)及阻抗來確定目標(biāo)檢測(cè)物的濃度[3]，并以此劃分為電流型[4]、阻抗型[5]和電位型[6]免疫傳感器。

1.1 電流型免疫傳感器

電流型免疫傳感器是免疫技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合的標(biāo)記型免疫分析，它是將生物識(shí)別元件通過單一抗體或雙抗體夾心方法的方式發(fā)生免疫反應(yīng)并修飾在傳感器表面，同時(shí)清洗去除表面的非特異性吸附，最終通過測(cè)定免疫反應(yīng)引起的電流變化實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)的檢測(cè)。最早構(gòu)建的電流型免疫傳感器是用于檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素[7]。隨著研究的不斷推進(jìn)，利用電化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的研究日益增多，電流型免疫傳感器也因此取得很大的進(jìn)步。至今，電流型免疫傳感器的標(biāo)記物分為生物酶（如堿性磷酸酶、乳酸脫氧酶、葡萄糖氧化酶、尿素水解酶等）和電活性物質(zhì)（如二茂鐵、對(duì)氨基酚及其衍生物、金屬離子、聚苯胺等）。王曼麗等利用Pt-Pd雙金屬納米材料修飾石墨烯作為載體，固載已標(biāo)記的抗體分子，構(gòu)建高特異性、高靈敏的電流型免疫傳感器[8]。Liu Tingzhi等以有機(jī)框架材料作為基底，構(gòu)建了一種超靈敏的夾心式免疫傳感器，用于檢測(cè)C反應(yīng)蛋白[9]。因電流型免疫傳感器具有高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛用于醫(yī)學(xué)、食品和環(huán)境等領(lǐng)域中蛋白質(zhì)及一些小分子物質(zhì)的檢測(cè)中。

1.2 阻抗型免疫傳感器

阻抗分析方法能夠分析電極表面物質(zhì)的反應(yīng)特性[10]，抗原-抗體發(fā)生反應(yīng)后會(huì)降低電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率，阻抗增加，可通過測(cè)定反應(yīng)前后的阻抗變化來判斷被檢測(cè)物的濃度。阻抗譜包含一段半圓曲線和一段直線，分別出現(xiàn)在高頻區(qū)和低頻區(qū)，電子轉(zhuǎn)移速率控制半圓曲線部分，電荷擴(kuò)散影響直線部分。阻抗型免疫傳感器能夠靈敏地表征電極表面的變化，應(yīng)用前景廣闊。Cordeiro等研制了首個(gè)無標(biāo)記電化學(xué)阻抗免疫傳感器，使用印刷電極檢測(cè)嬰兒利什曼原蟲抗體，成功研制出一種靈敏、快速、便捷的免疫傳感器，用于利什曼病的診斷[11]。游凱豪等構(gòu)建了非標(biāo)記阻抗型免疫傳感器用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1AC，檢測(cè)限可達(dá)0.8 ng/mL[12]。

1.3 電位型免疫傳感器

電位型免疫傳感器具有高靈敏度、高選擇性，可以直接或間接檢測(cè)抗原（抗體），做到實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。常用的氣敏電極為CO2、NH3、O2等，離子選擇電極為氟離子電極、三甲基苯胺陽離子電極和電離子電極等。不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，在免疫反應(yīng)發(fā)生前后電極表面的極性和密度都會(huì)隨之發(fā)生變化，最終使得電位發(fā)生變化，電位型免疫傳感器便是基于反應(yīng)前后電位變化進(jìn)行免疫分析。Silva等以金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）聚合物包合膜實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，構(gòu)建了無標(biāo)記的電位型免疫傳感器用于鼠傷寒沙門氏菌的高靈敏檢測(cè)[6]，在此基礎(chǔ)上，Silva等研發(fā)了一種新的基于紙張的無標(biāo)簽電位免疫傳感器用于檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，以紙為基礎(chǔ)的條形電極與濾紙墊集成，設(shè)計(jì)了一種簡單經(jīng)濟(jì)的方法控制通過聚合物膜的離子通量，通過電化學(xué)阻抗譜用來評(píng)估修飾步驟及分析檢測(cè)結(jié)果[13]。

2 納米材料在免疫傳感器中的應(yīng)用

納米材料具有一系列優(yōu)異的光學(xué)特性，其在免疫傳感器中的應(yīng)用大大提高了傳感器的性能，功能化的納米復(fù)合材料不但能加速信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)還能放大識(shí)別信號(hào)[14-16]。目前免疫傳感器技術(shù)已逐步成熟，主要有3 種機(jī)制被用來提高免疫傳感器的靈敏度：1）利用新型納米材料的大比表面積和電子轉(zhuǎn)移能力，盡可能增大修飾電極的比表面積并提高電子轉(zhuǎn)移率；2）利用生物相容性使納米材料與蛋白相結(jié)合，通過作為受體分子和酶標(biāo)抗體的納米載體來放大免疫反應(yīng)；3）利用新型納米材料本身特性作為生物探針實(shí)現(xiàn)放大信號(hào)的作用，例如碳納米材料、有機(jī)框架材料、金屬納米粒子及其復(fù)合物。圖1為納米材料電化學(xué)傳感器構(gòu)建技術(shù)原理。目前，廣泛用于免疫傳感器具有代表性的納米材料有富勒烯（C60）、碳納米管、石墨烯、類石墨烯材料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、金屬有機(jī)框架材料（metal-organic frameworks，MOFs）等。隨著研究的不斷推進(jìn)，越來越多的新材料被用于電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建中。

圖1 納米材料電化學(xué)傳感器構(gòu)建技術(shù)原理Fig. 1 Schematic diagram of the construction of nanomaterial electrochemical sensors

2.1 碳納米材料

2.1.1 富勒烯

富勒烯（C60）是一種碳單質(zhì)球形納米材料，其高度對(duì)稱的結(jié)構(gòu)使其具有獨(dú)特的光電性能，生物相容性優(yōu)異，自被發(fā)現(xiàn)以來便受到廣泛關(guān)注。在電化學(xué)領(lǐng)域，將C60及其復(fù)合物用于電化學(xué)傳感器的構(gòu)建，其大比表面積和超導(dǎo)性增強(qiáng)了電信號(hào)，大大提高了傳感器的靈敏度，成為目前新型納米材料的研究熱點(diǎn)。Demirbakan等[17]用C60修飾電極，并將抗體通過試劑偶聯(lián)在C60層上，采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗法對(duì)過程進(jìn)行表征并測(cè)定熱激蛋白70，所得傳感器的檢測(cè)范圍為0.8～12.8 pg/mL。Anusha等[18]通過C60和銅鎳雙金屬納米粒復(fù)合修飾電極構(gòu)建傳感器，用于檢測(cè)血液中VD的濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示檢測(cè)限為0.002 5 μmol/L。

2.1.2 碳納米管

碳納米管是一種由石墨烯片層卷構(gòu)形成的一維納米材料，依據(jù)結(jié)構(gòu)分為單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管。碳納米管化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有較大的比表面積、優(yōu)良的導(dǎo)電性和較好的生物相容性，同時(shí)，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其易于被功能化。功能化的碳納米管在其原有的特性上具有更佳的光電性能，增強(qiáng)了對(duì)物質(zhì)的吸附能力[19]，可連接特定的基團(tuán)從而對(duì)某種物質(zhì)進(jìn)行特異性吸附。Gulati等[20]利用垂直排列的多壁碳納米管構(gòu)建了免疫傳感器用于耐藥白血病細(xì)胞的檢測(cè)，使用阿霉素對(duì)白血病K562細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為10 個(gè)/mL，該方法具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。Rizwan等[21]通過由AuNPs及SWCNTs等組成的復(fù)合材料構(gòu)建了高靈敏的免疫傳感器，用于臨床腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原的檢測(cè)。在電化學(xué)分析中，碳納米管作為一種電極材料，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，成為電化學(xué)傳感器研究的熱點(diǎn)。

2.1.3 石墨烯

石墨烯是目前應(yīng)用十分廣泛的一種二維碳納米材料，具有良好的導(dǎo)電導(dǎo)熱性能，比表面積大。石墨烯獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且易于功能化。在電化學(xué)傳感領(lǐng)域中，石墨烯因其優(yōu)異的導(dǎo)電性能，大大提高了傳感器的靈敏度，同時(shí)，功能化的石墨烯為特異性識(shí)別提供了條件。Ren Qunxiang等[22]基于氧化石墨烯和AuNPs修飾電極，構(gòu)建了一種高靈敏的免疫傳感器，用差分脈沖法在pH 7.4的緩沖液中檢測(cè)三聚氰胺，在最優(yōu)條件下，檢出限達(dá)到2.66×10-7μmol/L。Fan Yan等[23]合成氧化石墨烯/硫堇/AuNPs納米復(fù)合材料，涂覆于電極表面，用于糖類抗原125抗體固定和檢測(cè)信號(hào)的放大，檢測(cè)限為0.01 U/mL，結(jié)果表明，這種免疫傳感器檢測(cè)的血清樣品與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果一致，相對(duì)誤差小于8.05%，且具有良好的重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。石墨烯由于制備方法簡單、快速、成本低，已經(jīng)成為構(gòu)建免疫傳感器的首選納米材料之一。

2.2 類石墨烯材料

類石墨烯材料是一類厚度為幾納米的二維納米材料，其原子的不同排列方式導(dǎo)致了性質(zhì)的不同，致使它們廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。類石墨烯材料主要包括氮化硼（BN）、過渡金屬氧化物及過渡金屬硫化物，其中，應(yīng)用較多的有二硫化鉬（MoS2）、二硫化鎢（WS2）等。

2.2.1 二硫化鉬

MoS2作為一種典型的過渡金屬硫化物，具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)。納米MoS2性質(zhì)穩(wěn)定，具有較大的比表面積，其吸附性能強(qiáng)，在電化學(xué)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。合成方法的不同，將導(dǎo)致傳感器性能的不同，MoS2的合成分為自上而下法（液相超聲法、鋰離子插層法和微機(jī)械剝離法等）和自下而上法（化學(xué)氣相沉積法和水熱法）。純MoS2導(dǎo)電性差，常與其他導(dǎo)電材料合成復(fù)合納米材料，以增強(qiáng)其導(dǎo)電性[24]。常用于組合的納米材料包括碳納米管、AuNPs及磁性納米粒子等。Zhu Dan等[25]通過MoS2-Ti-AuNPs納米復(fù)合材料構(gòu)建了生物傳感器，用以檢測(cè)microRNA-21，AuNPs的加入增強(qiáng)了其導(dǎo)電性。Cao Xiaoyu[26]制備了AuNPs/MoS2/石墨烯納米復(fù)合材料，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大作用，能高靈敏地檢測(cè)DNA。

2.2.2 二硫化鎢

WS2是一種形狀類似三明治的層狀材料，由于原子排列方式和層間堆垛方式的不同，WS2具有不同的結(jié)構(gòu)，有一定還原性。WS2較強(qiáng)的表面效應(yīng)和較大的比表面積使其廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，是近年來熱門研究的新型納米材料之一。Kong Weisu等[27]以AuNPs/WS2納米棒陣列修飾電極、銀納米粒子/片狀鋅金屬-有機(jī)骨架（Ag/ZnMOF）納米酶為載體，構(gòu)建了一種超靈敏光電生物傳感器，用于檢測(cè)博來霉素，檢測(cè)限為0.18 nmol/L。Zhang Zhouxiang等[28]基于SWCNTs納米復(fù)合二維層狀硫化鎢納米片構(gòu)建了高靈敏的電化學(xué)傳感器，用于檢測(cè)VB2，將含有氧化石墨烯的SWCNTs分散液滴涂于電極表面，用WS2改善其結(jié)構(gòu)的致密性和平穩(wěn)性，成功地應(yīng)用于VB2藥物樣品的檢測(cè)中，檢測(cè)限為0.7 nmol/L。

2.3 熒光納米材料

2.3.1 量子點(diǎn)

量子點(diǎn)是近期發(fā)現(xiàn)的能夠產(chǎn)生熒光的納米級(jí)半導(dǎo)體顆粒。目前研究較多且具有巨大應(yīng)用前景的量子點(diǎn)為CdX（X＝S、Se、Te）。量子點(diǎn)獨(dú)特的光吸收特性，如量子表面效應(yīng)、尺寸效應(yīng)、量子隧道效應(yīng)及介電限域效應(yīng)等，使其具有穩(wěn)定性好、熒光壽命長、熒光強(qiáng)度高、可多次激發(fā)等優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)成功引起研究者的關(guān)注，將其作為熒光標(biāo)記探針應(yīng)用于各領(lǐng)域，成為最具潛力和應(yīng)用價(jià)值的新型納米材料。電致發(fā)光則是利用量子點(diǎn)優(yōu)異的光電性能，將光與電化學(xué)分析相結(jié)合，形成一種十分靈敏的檢測(cè)方法。Qiu Youyi等[29]在電極表面加載聚苯胺，以CdS量子點(diǎn)為發(fā)光信號(hào)源，并利用AuNPs固定MCF-7腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。Cadkova等[30]將CdSe/ZnS量子點(diǎn)與抗體偶聯(lián)構(gòu)建了一種無酶量子點(diǎn)磁免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人血清附睪蛋白4的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到12 pmol/L。

2.3.2 熒光碳點(diǎn)

碳點(diǎn)是一種零維的半導(dǎo)體納米材料，粒徑一般小于10 nm。碳點(diǎn)具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，易于功能化，且具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性、低毒性等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，制備碳點(diǎn)的原料種類豐富、價(jià)格低廉，逐步成為研究者的焦點(diǎn)，在傳感器的應(yīng)用中具有很好的應(yīng)用前景。基于碳量子電池碳量子點(diǎn)構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光傳感器逐步受到關(guān)注，其因獨(dú)特的光電特性，被用于構(gòu)建熒光探針應(yīng)用于各種分析物的高靈敏檢測(cè)，包括金屬離子[31]，生物分子[32]及殺菌劑[33]等。隨著對(duì)碳點(diǎn)研究的深入，更多的方法被用來提高分析的特異性和靈敏度，比如在碳點(diǎn)表面偶聯(lián)具有特異性識(shí)別作用的適配體及分子印跡聚合物，而碳點(diǎn)也逐步被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的研究中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定蛋白的標(biāo)記和高靈敏分析。

2.3.3 金屬有機(jī)框架材料

MOFs是有機(jī)配體和金屬離子或團(tuán)簇發(fā)生配位而構(gòu)建形成的新型多孔材料，結(jié)合了無機(jī)材料與有機(jī)材料的優(yōu)點(diǎn)。其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)決定了MOFs具有比表面積大、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好、孔徑結(jié)構(gòu)可調(diào)、吸附性能良好等特性，因而倍受關(guān)注。改性MOFs制備出的復(fù)合材料可使其更有效地檢測(cè)生物分子、陰離子、陽離子、有機(jī)化合物等不同物質(zhì)，因此，MOFs成為構(gòu)建靈敏傳感器的最佳候選材料[34]。由于MOFs的巨大空體積限制了其導(dǎo)電性，且其中大多屬絕緣材料，選擇合適的材料與MOFs結(jié)合修飾，可使MOFs具有獨(dú)特的光電特性。MOFs納米復(fù)合材料現(xiàn)已被用于多種重要分析物的傳感檢測(cè)，用于合成MOFs納米復(fù)合材料進(jìn)行光電電化學(xué)檢測(cè)的材料主要包括碳基材料、金屬/金屬氧化物納米顆粒、量子點(diǎn)、酶和雜多酸[35]。

Li Jun等[36]用石墨烯制備復(fù)合材料檢測(cè)對(duì)苯二酚和鄰苯二酚等污染物，超聲分散Cu-MOF和氧化石墨烯，并滴于電極表面室溫干燥，結(jié)果表明Cu-MOF-氧化石墨烯復(fù)合材料在檢測(cè)中表現(xiàn)出良好的性能。He Yi等[37]利用AuNPs將MOF-CoFe2O4磁性納米粒子功能化，合成MOFCoFe2O4＠AuNPs夾心型免疫傳感器，用以檢測(cè)N端腦前列鈉肽。何曉靜等[38]基于MOFs固載碲化鎘量子點(diǎn)（CdTe quantum dots，CdTe QDs）合成CdTe＠MOFs/CdTe QDs復(fù)合物，構(gòu)建電致發(fā)光免疫傳感器，用以檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I。

除了上述幾種常見納米材料，應(yīng)用于電化學(xué)傳感器研究中的納米粒子還有貴金屬納米粒子（如金、銀、鈀、鉑等）、納米金屬氧化物及納米復(fù)合材料。貴金屬納米材料在具有納米材料特性的同時(shí)還具有金屬自身的物化性質(zhì)，成為納米材料研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，吸引許多學(xué)者在其制備、性能及應(yīng)用方面不斷探索研究并取得一定成果。如銀納米材料能夠快速促進(jìn)電催化，加速電子轉(zhuǎn)移速率，實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的靈敏檢測(cè)[39]。Wang Zihua等[40]構(gòu)建了一種以AuNPs、硫堇、羧化多壁碳納米管復(fù)合材料為底物的免疫傳感器用于檢測(cè)白細(xì)胞介素-6。隨著對(duì)貴金屬納米粒子研究的深入，一種新型熒光貴金屬納米簇被發(fā)現(xiàn)，其具有在可見光到近紅外光區(qū)范圍內(nèi)熒光可調(diào)諧的優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)[41]，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[42]。

3 電化學(xué)免疫傳感器在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著研究者的不斷努力，越來越多便捷快速的檢測(cè)方法出現(xiàn)并應(yīng)用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)中，如表1所示，每種檢測(cè)方法都有一定的缺陷，而與其他檢測(cè)方法相比，電化學(xué)傳感器攻克了高成本、低靈敏度、易受干擾等問題，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的蛋白質(zhì)檢測(cè)中。

表1 常用蛋白質(zhì)檢測(cè)方法Table 1 Common protein detection methods

3.1 食品分析

3.1.1 食品過敏原檢測(cè)

食品過敏原是能夠引起宿主對(duì)食物產(chǎn)生不良反應(yīng)的一類物質(zhì)，主要為來源于海鮮、大豆、牛奶、蛋品等食物中的蛋白質(zhì)[43]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫學(xué)分析是檢測(cè)食物中過敏原的主要方法。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，傳感技術(shù)逐漸應(yīng)用于食品中過敏原的檢測(cè)。Yang Chi等[44]用氧化鋅-量子點(diǎn)復(fù)合材料修飾電極構(gòu)建了伴刀豆蛋白標(biāo)記的傳感器，用于檢測(cè)過敏原雞卵類黏蛋白。Eissa等[45]將石墨烯修飾于電極表面，羧基活化后連接卵白蛋白抗體構(gòu)建卵白蛋白免疫傳感器，對(duì)蛋糕提取物中的卵蛋白進(jìn)行檢測(cè)，此外該作者用同類免疫傳感器對(duì)牛奶中的過敏原β-乳球蛋白進(jìn)行檢測(cè)[46]，其檢出限和檢測(cè)范圍都達(dá)到了令人滿意的結(jié)果。Montiel等[47]將磁性微球羧基化后修飾于電極表面并連接花生蛋白Ara h1抗體，然后逐層固定花生蛋白Ara h1、標(biāo)記抗體和標(biāo)記辣根過氧化物酶，得到雙重信號(hào)放大的免疫傳感器。Kong Weijun等[48]將納米粒子和殼聚糖混合液修飾于電極表面形成氨基薄膜，固載AuNPs得到發(fā)光型免疫傳感器，進(jìn)而得到卵轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度與發(fā)光強(qiáng)度的線性關(guān)系。

3.1.2 牛奶蛋白檢測(cè)

酪蛋白是牛奶營養(yǎng)的主要成分，酪蛋白含量是判斷乳品中是否摻假的重要指標(biāo)。電化學(xué)傳感器在牛奶檢測(cè)中的應(yīng)用克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法成本高、耗時(shí)長、需專業(yè)人員操作等弊端。免疫傳感器的應(yīng)用能夠有效、高靈敏地檢測(cè)牛奶中的酪蛋白。Cao Qian等[49]基于AuNPs/多壁碳納米管構(gòu)建了免疫傳感器用以檢測(cè)酪蛋白，并對(duì)AuNPs的吸附時(shí)間、電解質(zhì)pH值和孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終檢測(cè)限達(dá)到5×10-8g/mL。

3.1.3 農(nóng)作物中轉(zhuǎn)基因蛋白檢測(cè)

目前，針對(duì)轉(zhuǎn)基因蛋白的檢測(cè)并沒有許多高效靈敏的檢測(cè)方法，電化學(xué)免疫傳感器在轉(zhuǎn)基因蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，逐漸成為研究熱點(diǎn)。Zhu Xiaolei等[50]基于量子點(diǎn)構(gòu)建了熒光酶聯(lián)免疫傳感器，用以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因MON810玉米的Cry1Ab蛋白。游凱豪等[12]構(gòu)建了非標(biāo)記阻抗型電化學(xué)免疫傳感器，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品中Cry1Ac蛋白含量進(jìn)行了檢測(cè)，最低檢測(cè)限達(dá)到0.8 ng/mL。Gao Hongfei等[51]將魯米諾作為信號(hào)探針構(gòu)建了電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，對(duì)轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab進(jìn)行了定量檢測(cè)，且該傳感器成功用于實(shí)際轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)中。由于轉(zhuǎn)基因作物的種植與安全性受到公眾的高度重視，電化學(xué)傳感器檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的方法仍需更多深入的研究以普及到實(shí)際應(yīng)用中。

3.2 醫(yī)療檢測(cè)

近年來免疫傳感器用于蛋白檢測(cè)的報(bào)道不斷涌現(xiàn)，表2對(duì)部分用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的電化學(xué)傳感器進(jìn)行了總結(jié)。

表2 電化學(xué)傳感器用于蛋白質(zhì)檢測(cè)Table 2 Electrochemical sensors used for protein detection

在臨床診斷中，許多蛋白被用作一些疾病的識(shí)別，通過對(duì)高特異性的標(biāo)記蛋白進(jìn)行檢測(cè)而確診疾病。Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，聚集于神經(jīng)性疾病的細(xì)胞內(nèi)。國外對(duì)于應(yīng)用傳感器檢測(cè)Tau-381蛋白質(zhì)的研究也相對(duì)較少，Esteves-Villanueva等[56]同樣構(gòu)建了生物傳感器來檢測(cè)折疊的Tau蛋白。Derkus等[57]利用納米免疫傳感器檢測(cè)到了0.15 nmol/L Tau蛋白。Dai Yifan等[58]構(gòu)建了一種一次性的生物傳感器，用于檢測(cè)人體血清中的Tau蛋白。Xu Wei等[59]合成了納米盒金屬-有機(jī)骨架復(fù)合材料，并應(yīng)用于免疫傳感器中，利用SiO2標(biāo)記抗lag3抗體，對(duì)淋巴細(xì)胞活化基因3（lag 3）蛋白進(jìn)行超敏定量檢測(cè)，檢測(cè)限為1.1 pg/mL。Gao Ning等[60]通過水熱法合成Zn∶SnO2/SnS2納米復(fù)合材料，構(gòu)建了無標(biāo)記光電化學(xué)免疫傳感器用以檢測(cè)β淀粉樣蛋白，Zn的加入顯著提高了電流值，最終檢測(cè)限低至0.05 pg/mL（信噪比為3）。

近年來對(duì)靶標(biāo)蛋白質(zhì)分子的檢測(cè)主要依賴于免疫學(xué)方法，常規(guī)的免疫學(xué)方法難以準(zhǔn)確檢測(cè)低濃度靶標(biāo)蛋白質(zhì)，而免疫傳感器的應(yīng)用彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)。電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合了抗原抗體的特異性反應(yīng)和新型納米材料的優(yōu)質(zhì)特性，能夠做到高選擇性、高靈敏性、快速、簡便地檢測(cè)，在蛋白質(zhì)檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 語

基于納米材料的不斷研究，越來越多的新型材料用于免疫傳感器的構(gòu)建中，極大地提高了檢測(cè)的靈敏度。熒光納米材料以其特有的光學(xué)性質(zhì)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)中，其中磁性熒光納米材料合成技術(shù)成熟但在蛋白質(zhì)檢測(cè)中應(yīng)用較少，未來仍有巨大的發(fā)展空間。更多基于新型有機(jī)、無機(jī)納米材料構(gòu)建的免疫傳感器正逐步應(yīng)用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)中，選用合適的修飾材料后，如何用最簡便的方式極大地實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大成為目前研究的一個(gè)挑戰(zhàn)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，未來在蛋白質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域仍需以下優(yōu)化：1）提高電極的品質(zhì)和靈敏度，在此基礎(chǔ)上研究新型傳感器，使其便于攜帶；2）進(jìn)一步開發(fā)導(dǎo)電性強(qiáng)、生物相容性高、環(huán)保的新型納米材料；3）進(jìn)一步優(yōu)化電化學(xué)免疫傳感器的信號(hào)放大策略，簡化探針構(gòu)建過程，實(shí)現(xiàn)超靈敏檢測(cè)；4）發(fā)展微型化的多電極模式，提高檢測(cè)通量。