馬碧云綜述，楊傳坤，陳克平審校

0 引 言

病毒是最小、最簡單的無細胞結(jié)構(gòu)微生物。病毒由核心和衣殼組成，兩者形成核衣殼。核心由核酸組成，為病毒的復制、遺傳和變異提供遺傳信息。衣殼是包圍在核酸外面的蛋白質(zhì)外殼。與細菌等其他微生物感染性疾病相比，病毒性疾病傳染性強，傳播迅速，流行廣，特效藥物少，更加容易致病。最近蔓延全球的2019新型冠狀病毒 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)是人類分離的第七類冠狀病毒，是一種RNA病毒[1]。大部分RNA病毒傳染性較強，甚至導致重癥或死亡，因此在采樣和檢測過程中要注意生物安全防護。

目前主要利用實時熒光RT-PCR技術(shù)對SARS-CoV-2進行核酸檢測，此技術(shù)快速簡便、成本較低，可在早期或潛伏期內(nèi)識別微量的病毒顆粒[1]。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的各版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，均明確將核酸檢測陽性作為新型冠狀病毒感染確診標準；將連續(xù)兩次痰、鼻咽拭子等呼吸道標本核酸檢測陰性列為出院標準[2]。因此核酸檢測在新型冠狀病毒肺炎的確診和預后監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。國家藥監(jiān)局已經(jīng)批準了近20種熒光RT-PCR技術(shù)用于SARS-CoV-2檢測。然而有研究表明，僅有50%臨床確診病例核酸檢測為陽性[3]。核酸檢測低陽性率可能與樣本采集時機、采集部位，樣本運輸保存條件，以及試劑質(zhì)量和操作者水平等因素相關(guān)。同時，為保護實驗室與操作者，常采用加熱方式滅活病毒。然而有研究指出，加熱滅活使SARS-CoV-2核酸降解，甚至造成假陰性結(jié)果[4-5]。本文主要就加熱滅活處理方式及其對病毒RNA檢測的影響，尤其對SARS-CoV-2核酸檢測的影響，并提出了一些可供參考的解決方法以降低核酸檢測假陰性率。

1 加熱滅活病毒機制

對疑似新型冠狀病毒肺炎患者的標本進行運輸、RNA抽提、擴增等均為高風險操作，操作者面臨“職業(yè)暴露”的風險，必須佩戴三級生物安全個人防護[6]。而加熱處理可滅活病毒，可有效保障實驗室與操作者的生物安全。加熱滅活病毒首先會使病毒的結(jié)構(gòu)蛋白變性，從而改變宿主細胞內(nèi)參與附著和復制的病毒蛋白構(gòu)象，致使病毒喪失與細胞受體的結(jié)合能力，以終止病毒感染[7]。冠狀病毒膜蛋白的熱聚集也可能是病毒失活的原因[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)，加熱處理僅裂解病毒衣殼并改變蛋白構(gòu)象，但不破壞病毒基因組[9]。

2 加熱處理可有效降低病毒傳染性

病毒滅活方式主要是75%乙醇處理滅活和加熱滅活。加熱滅活在不同的研究中采用的方案不同。1型脊髓灰質(zhì)炎病毒經(jīng)75 ℃加熱處理1 h后可失活，柯薩奇病毒B3經(jīng)55 ℃加熱處理15 min后，病毒顆粒被破壞，失去傳染性[9]。Kariwa等[10]也發(fā)現(xiàn)將SARS病毒在56 ℃加熱5 min后，可將病毒感染性從2.6107減少至40TCID50/mL，在56 ℃加熱處理60 min或更長時間可完全消除病毒的感染性。諾如病毒經(jīng)80 ℃加熱處理5 min后，17株菌中有16株病毒(94%)的滴度顯著降低，平均下降1.1至3.9 log10[11]。關(guān)于SARS-CoV和MERS-CoV的研究也證實，加熱處理可使冠狀病毒失活[12]。

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬醫(yī)院推薦將SARS-CoV-2標本在56 ℃條件下干浴30 min，靜置10 min，使氣溶膠沉降后再進行核酸檢測，可有效滅活此病毒并降低傳染性[13]。新型冠狀病毒肺炎核酸檢測專家共識則推薦56 ℃加熱30 min，或60～65 ℃加熱20 min，加熱過程中每隔10 min輕柔搖勻標本1次，可降低SARS-CoV-2的傳染性[14]。發(fā)表在bioRxiv上的研究認為，92 ℃加熱15 min的方案比56 ℃加熱30 min或60 ℃加熱60 min的方案更有效；56 ℃加熱處理30 min 或60 ℃加熱處理60 min的滅活方案，雖可降低病毒載量，但仍有不高于10 TCID50/mL的病毒感染性，而92 ℃加熱15 min方案可徹底滅活SARS-CoV-2[15]。

3 加熱處理易導致核酸檢測假陰性結(jié)果

RNA病毒所含遺傳物質(zhì)RNA穩(wěn)定性差，易被來自于實驗環(huán)境、試劑、耗材等外源或細胞破壞后所釋放的內(nèi)源RNA酶降解。尤其加熱處理后，病毒顆粒的核酸核糖酶被充分激活，導致病毒RNA降解很快。張沁欣等[16]提取斑馬魚胚胎細胞RNA進行實驗，證實在無核糖核酸酶抑制劑的保護下，56℃滅活處理將導致RNA的明顯降解。因此加熱處理可破壞病毒RNA基因組的完整性，同時可減少可用于檢測的核酸數(shù)量。

在新型冠狀病毒感染爆發(fā)初期，有研究表明加熱滅活不會造成SARS-CoV-2檢出率下降[17]。如魏喜生等報道56 ℃水浴處理30 min不會對SARS-CoV-2核酸檢測產(chǎn)生影響：將加熱滅活標本和未滅活標本比較，對咽拭子或痰液標本均無明顯影響，Ct值差異無統(tǒng)計學意義[18]。同時，陳培松等研究報道56℃加熱處理30 min或75%乙醇處理咽拭子標本，對SARS-CoV-2核酸檢測均無明顯影響[17]。但此兩篇報道所用樣本例數(shù)偏少，研究結(jié)論需進一步驗證。近期越來越多的研究表明，加熱滅活過程對于SARS-CoV-2病毒含量較高的樣本檢測結(jié)果無明顯影響，但可能會導致病毒含量較低樣本的病毒檢出率下降，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果[4-5，19]，并且加熱溫度越高對RNA完整性破壞性越強，假陰性率越高[15]。有文獻研究發(fā)現(xiàn)，將弱陽性標本經(jīng)加熱處理后，近一半的樣本呈現(xiàn)假陰性結(jié)果，說明加熱滅活會降低SARS-CoV-2的RNA載量，檢測Ct值變大[4]。劉潔等[20]加熱處理咽拭子樣本，發(fā)現(xiàn)核酸檢測Ct 值變大，或 PCR擴增曲線不明顯。本科室利用國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心自研的噬菌體病毒樣顆粒樣本用于SARS-CoV-2核酸檢測室內(nèi)質(zhì)控， 56 ℃加熱處理質(zhì)控品30 min后，核酸檢測Ct值增大，并且加熱處理時間越長，Ct值增大越明顯。當然，病毒加熱滅活處理對RNA檢測的影響程度與樣本的采集質(zhì)量、病毒濃度、保存液、試劑盒質(zhì)量等均有較大關(guān)系，有文獻發(fā)現(xiàn)不同的加熱裝置和不同的樣本量也會影響核酸的提取和擴增效率[20]。

4 降低加熱對RNA檢測影響可采取的應對措施

SARS-CoV-2診療方案與核酸檢測專家共識均建議在檢測前加熱處理樣本滅活SARS-CoV-2，防止生物安全隱患發(fā)生。加熱帶來的假陰性問題也值得關(guān)注。為了降低檢測的假陰性率，以下對策可供參考。

4.1選擇合適的樣本保存液新型樣本保存液可提高加熱處理后樣品中的病毒核酸可檢出量。張沁欣等[16]將293T細胞系保存在三種不同成分的保存液中，經(jīng)過高溫處理后提取樣本中的RNA。結(jié)果顯示，含SDS成分的保存液保存的RNA質(zhì)量較好，含SDS與蛋白酶K雙組分的保存液保存的RNA質(zhì)量最好，28S和18S條帶均明顯可見且無拖尾現(xiàn)象。這些結(jié)果提示SDS可能具有保護RNA免受RNAase降解的作用。

4.2選擇滅活型病毒保存液病毒保存液如含有高濃度胍鹽，胍鹽具有強烈的蛋白變性作用，可在短時間內(nèi)迅速破壞病毒的蛋白外殼，同時抑制核糖核酸酶。所以含胍鹽的病毒保存液既能有效滅活病毒，又能保護RNA不被降解[3]。研究發(fā)現(xiàn)，保存在病毒保存液AVL中的病毒RNA可在32 ℃穩(wěn)定48 h，在4 ℃或-20 ℃環(huán)境下至少可保存35 d[21]。這種滅活型病毒保存液具有較高的生物安全性，無需后續(xù)加熱滅活處理。因此，使用含胍鹽的保存液采集樣本，在滅活病毒的同時可穩(wěn)定病毒RNA，而不影響后續(xù)的SARS-CoV-2檢測[3]。

4.3同時檢測多類型樣本呼吸道病毒感染患者可檢測標本類型多樣，在SARS-CoV, MERS-CoV等病毒感染者的上下呼吸道、糞便、血液和尿液中均可檢測到病毒RNA。下呼吸道SARS-CoV-2含量明顯高于上呼吸道；肺泡灌洗液中最容易檢測出病毒核酸，其次是深痰液，再是鼻咽部，再次是口咽部[22]。目前在加熱滅活導致假陰性產(chǎn)生的研究中，所選標本類型中90%為咽拭子，即上呼吸道標本。但也有相關(guān)研究證實，加熱滅活對不同的標本的影響程度不一致；糞便標本的影響最大，而對痰標本無明顯影響[23]。因此在檢測多種標本時，需結(jié)合實際情況判斷。

4.4提高樣本采集質(zhì)量制定樣本采集標準操作程序，加強對樣本采集人員的培訓與考核。采集過程中應控制好采樣的距離、力度和時間，盡量避免觸碰腺體。要避免樣本長時間暴露在外界環(huán)境中，因為外界廣泛存在的RNA酶易導致核酸降解[24]。使用重組質(zhì)粒、假病毒顆粒、RNAase P基因以及呼吸道上皮細胞的管家基因等作為內(nèi)標可以有效監(jiān)控SARS-CoV-2核酸檢測的擴增步驟，而RNAase P基因存在各種類型的SARS-CoV-2樣本中，可作為內(nèi)源性內(nèi)標可監(jiān)控從樣本采集至擴增的SARS-CoV-2核酸檢測全過程[3]。

4.5抗體檢測作為補充SARS-CoV-2的核酸檢測為陰性時，可采用其他檢測方法作為補充。薛雄燕等[25]研究發(fā)現(xiàn)56 ℃加熱30 min處理SARS-CoV-2血液樣本，對采用免疫層析法及化學發(fā)光免疫分析法檢測SARS-CoV-2抗體無影響。但有研究顯示56 ℃加熱30 min處理可大幅降低所有樣本SARS-CoV-2的IgM滴度，以及64.71%樣本的IgG滴度[26]。因此抗體檢測僅可作為診斷SARS-CoV-2感染的補充。

4.6可靠的核酸檢測試劑與規(guī)范的臨床實驗室目前獲批的近20種SARS-CoV-2核酸檢測試劑中，檢出限從100 copies/mL(華大生物等)至1000 copies/mL(上海伯杰、上海之江等)不等。敏感度低的檢測試劑無法檢測出由于加熱變性導致RNA載量降低的陽性樣本，導致假陰性率升高。因此，高敏感性的核酸檢測試劑可在一定程度上避免假陰性產(chǎn)生。同時，嚴格的標準操作程序、完善的質(zhì)量控制措施可減少實驗操作造成的假陰性。

5 結(jié)語與展望

選擇正確的病毒滅活方式對保障核酸檢測的生物安全是非常必要的。加熱滅活作為實驗室主要滅活方法之一，被廣泛應用于各類強傳染性病毒，如埃博拉病毒、新型冠狀病毒、SARS病毒等。同時我們也應注意到，加熱處理可降低病毒RNA載量，溫度越高對RNA破壞作用越大，從而導致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。在規(guī)范實驗操作前提下，選擇具有RNA保護作用的病毒保存液，或直接使用含胍鹽成分的滅活型病毒保存液保存樣本，同時檢測不同病程采集的多種類型樣本以及抗體檢測作為補充的處理措施，均可有效降低加熱處理導致假陰性帶來的臨床風險。新型冠狀病毒肺炎診療方案與核酸檢測專家共識均推薦56 ℃加熱處理30 min滅活SARS-CoV-2，然而臨床實驗室采用何種滅活方案需經(jīng)過實驗驗證，在滅活病毒前提下選擇合適的滅活方案，減少對RNA的破壞作用，最大程度減少假陰性產(chǎn)生。