魏海霞 馬玉珍 劉德璽 李永濤 王莉莉 周健 楊慶山

(山東省林業(yè)科學研究院，濟南，250014)

豆梨(PyruscalleryanaDecne.)為薔薇科梨屬落葉喬木，被認為是最古老的梨屬種之一[1-2]，為我國原生樹種，是集觀花、觀葉為一體的優(yōu)良彩色景觀樹種[3]，廣泛分布于山東、河南、江蘇、浙江、江西、安徽、湖北、湖南、福建、廣東、廣西等省區(qū)。豆梨作為我國原生梨屬植物，其生長適應性、抗病性較強，常作栽培梨樹的嫁接砧木。除此之外，豆梨利用價值較多，具有材用、藥用、食用、園林綠化價值[4-5]。近年來，我國林業(yè)工作者開始重視豆梨資源，并將原產于我國的豆梨由美國反引了一些觀賞品種[6-8]，但這些品種資源的種植和推廣還未獲得普及，城鄉(xiāng)綠化建設中應用較少。截至目前本土選育的豆梨新品種、良種未見報道。

種子萌發(fā)，是植物生活史的關鍵階段，也是植物抗逆性最弱的時期，決定著植物的繁殖及種群持續(xù)、擴繁和恢復，具有重要的生物學和生產實踐意義[9]；種子萌發(fā)，也是植物引種、育苗的前提和主要環(huán)節(jié)。鹽脅迫會造成種子發(fā)芽慢、發(fā)芽受阻、種苗生長畸形等問題[10]，種子萌發(fā)期，耐鹽性評價對引種、耐鹽品種選育具有重要指導意義。

關于對種子耐鹽萌發(fā)的研究，已有研究成果主要集中在針對作物[11-13]、草本[14-16]及易萌發(fā)種子的研究[17-18]，而對有休眠期的木本植物種子耐鹽萌發(fā)的研究較少。為此，本研究在對野生豆梨種質資源進行引進調查的基礎上，以豆梨進口栽培品種‘紅塔’種子為試材，采用6個濃度的NaCl脅迫處理，測定鹽脅迫后豆梨種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、培養(yǎng)1～5 d的胚根長和胚芽長；以進口栽培品種‘首都’種子為對照，以7份野生豆梨種子為試材，采用濃度為200 mmol/L的NaCl脅迫處理，測定鹽脅迫后豆梨種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚根長、胚芽長。應用隸屬函數(shù)法、系統(tǒng)聚類分析法對種子耐鹽性進行綜合評價，分析鹽脅迫對豆梨種子萌發(fā)及生長的影響。旨在為耐鹽豆梨品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試豆梨種子于2019年采自日照嵐山、日照九仙山、臨沂蒙山(見表1)。將采集的豆梨果實歸堆漚制，沖洗后去雜，于干燥通風處晾干備用。

表1 供試種子及種源信息

1.2 試驗設計

試驗于2020年3月份在山東省林業(yè)科學研究院東營分院實驗室進行。將調制好的種子進行沙藏處理50 d，取出后洗凈，高錳酸鉀浸泡消毒，試驗備用。

在洗凈烘干的培養(yǎng)皿中放入2層濾紙，每個培養(yǎng)皿加5 mL鹽溶液，選取大小一致、籽粒飽滿的進口豆梨品種‘紅塔’種子(HT)，沖洗干凈，整齊放入培養(yǎng)皿中。每皿放置30粒種子，試驗分別設置6個NaCl濃度梯度，即0(對照)、50、100、200、300、400 mmol/L。定時補充蒸發(fā)的水分，保持鹽溶液的濃度，每處理重復3次，置于(溫度28 ℃、濕度75%、光照12 h)恒溫培養(yǎng)箱中。

另選取進口豆梨品種‘首都’種子(SD)為對照，和7個野生豆梨種質的種子(J2、J8、J10、M6、M13、M15、M24)，用濃度為200 mmol/L的NaCl溶液進行處理，測定各種質種子的耐鹽萌發(fā)情況。方法同上。

1.3 評價指標計量方法

以芽點突破種皮為發(fā)芽標志，每天定時記錄每個培養(yǎng)皿內種子萌發(fā)數(shù)量，每皿隨機抽取10粒種子，用測量尺測量胚根長、胚芽長，計算發(fā)芽勢=[(培養(yǎng)2 d發(fā)芽數(shù))/供試種子數(shù)]×100%、發(fā)芽率=[(培養(yǎng)3 d發(fā)芽數(shù))/供試種子數(shù)]×100%。

采用隸屬函數(shù)法對豆梨種質進行芽期耐鹽堿性綜合評價，計算隸屬函數(shù)值。U(Xij)=(Xij-Xij,max)/(Xij,max-Xij,min)；式中的U(Xij)為i種質j指標的隸屬函數(shù)值、Xij為i種質j指標的實測值、Xij,max為i種質j指標的最大值、Xij,min為i種質j指標的最小值。

1.4 數(shù)據處理

采用Excel2010和SPSS Statistics19軟件進行數(shù)據統(tǒng)計、利用DPS9.50軟件進行統(tǒng)計分析和耐鹽性系統(tǒng)聚類分析、采用鄧肯(Duncan)多重比較檢驗不同處理之間的差異性。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl處理對‘紅塔’種子萌發(fā)的影響

試驗發(fā)現(xiàn)，種子最早突破種皮的是胚根，試驗的前3 d內，可見白色的胚根逐漸增長。

由表2可見：隨著NaCl溶液濃度逐漸增大，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長均受到抑制而降低，各處理間胚根長均具有顯著差異(P<0.05)。濃度為50 mmol/L的NaCl溶液處理的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率，與對照相比差異不顯著，說明濃度為50 mmol/L的NaCl溶液處理對種子的萌發(fā)影響較?。坏?，濃度為100 mmol/L及以上的NaCl溶液處理，對種子萌發(fā)均有顯著抑制。濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理的種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長，顯著高于濃度為300 mmol/L的NaCl溶液處理的種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長(P<0.05)。當NaCl溶液濃度為300、400 mmol/L時，胚根在2～3 d間生長基本停滯，甚至萎蔫，因此處理3 d后，只測量NaCl溶液濃度小于等于200 mmol/L的胚根、胚芽生長狀況(見表3)。

隨著處理時間的延長，當處理時間達到4～6 d時，嫩綠色胚芽逐漸出現(xiàn)。由表3可見：隨著NaCl溶液濃度的增高，處理間胚根長、胚芽長均顯著低于對照(P<0.05)；隨著NaCl溶液濃度的降低，胚芽的生長速度高于胚根。

供試品種進口豆梨品種‘紅塔’，生長表現(xiàn)佳、抗性強，以此為例進行種子耐鹽試驗具有代表性。隨著處理液鹽濃度的增高，種子發(fā)芽、生長均受到不同程度的抑制。由表2、表3可見：當NaCl溶液濃度大于等于200 mmol/L時，種子的發(fā)芽、生長受到嚴重抑制。說明濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理，是篩選豆梨種子耐鹽性的關鍵濃度節(jié)點，在進行大量種質種子耐鹽性比較時，可直接選擇濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理，測定種子的耐鹽萌發(fā)及生長能力。

表2 不同濃度鹽脅迫時‘紅塔’種子萌發(fā)狀況及處理1～3 d時間種子胚根生長狀況

表3 不同濃度鹽脅迫4～6 d時‘紅塔’種子胚芽、胚根生長狀況

2.2 8種豆梨種子耐鹽萌發(fā)的比較

用濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理8個豆梨種質的種子，測得發(fā)芽1、3 d時胚根長(見表4)。M15種子，發(fā)芽1 d時胚根長為2.1 mm，比其他種質高出46.9%～100.0%；發(fā)芽3 d時胚根長為4.2 mm，高出其他種質61.5%～127.0%，顯著高于其他種質(P<0.05)。其他種質之間，胚根長差異不顯著(P>0.05)。

在種子發(fā)芽2 d時測算發(fā)芽勢、種子發(fā)芽3 d時測算發(fā)芽率(見表4)。由表4可見：M15種子的發(fā)芽勢為44.4%，顯著高于SD、M24、M13、J10、J2種子的發(fā)芽勢(P<0.05)，與J8、M6種子的發(fā)芽勢差異不顯著(P>0.05)。M15種子的發(fā)芽率為58.8%，顯著高于SD、M24、J10、J2種子的發(fā)芽率(P<0.05)，與M13、J8、M6種子的發(fā)芽率差異不顯著(P>0.05)。說明M15的耐鹽萌發(fā)能力最強，J8和M6次之，其他種質耐鹽萌發(fā)能力較弱，且各種質之間差異不顯著(P>0.05)。

隨著時間的延長，種子的胚根逐漸增長，但是增長速率逐漸減小，當生長到4 d，可見種子的綠色胚芽均突出種皮，胚芽的生長速度高于胚根。測算生長5 d時的胚芽、胚根生長情況(見表4)，由表4可見：M15種子的胚根長，顯著高于其他種質種子的胚根長(P<0.05)；其次是J8種子的胚根長；再次是SD、M24種子的胚根長。M15種子的胚芽長，顯著高于其他種質種子的胚芽長(P<0.05)；其次是M6種子的胚芽長；再次是J2、J10、M24種子的胚芽長。對照品種‘首都’(SD)為美國引進的彩葉豆梨品種，發(fā)芽率、發(fā)芽勢均顯著低于M15(P<0.05)，胚根長顯著低于M15、J8(P<0.05)，胚芽長顯著低于M15、M6、J2、J10、M24(P<0.05)，耐鹽萌發(fā)能力屬于中等水平。

表4 各種質在濃度為200 mmol/L的鹽脅迫時種子萌發(fā)狀況

2.3 豆梨種質耐鹽性綜合評價

采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對8種豆梨種質種子耐鹽能力進行綜合評價(見表5)。由表5可見：平均隸屬函數(shù)值的分布范圍為0.09～1.00，數(shù)值越大說明耐鹽能力越強；隸屬函數(shù)值的分布可以看出，各種質之間的耐鹽性差異較大。由各種質的平均隸屬函數(shù)值可看出，耐鹽能力最強的是M15，它的各項指標均最高。隸屬函數(shù)值在0.42～0.52之間的是M6、J8，耐鹽能力中等。耐鹽能力較弱的為M24、SD、M13、J10、J2，共5份種質，其隸屬函數(shù)值在0.09～0.29之間，其中M13綜合耐鹽能力最弱。

表5 豆梨種質各指標隸屬函數(shù)值及綜合排序

2.4 豆梨種質耐鹽性的聚類分析

依據歐氏距離，采用離差平方和法，對8種豆梨種質的耐鹽性進行聚類分析(圖1)。在歐式距離3.00處，可將參試材料分為三大類群：第Ⅰ類(Ⅰ級)為M15，屬于高耐鹽種質，占供試材料的12.5%；第Ⅱ類(Ⅱ級)有2份種質材料，包括M6、J8，為中等耐鹽種質，占供試材料的25%；第Ⅲ類(Ⅲ級)有5份種質材料，包括M24、SD、M13、J10、J2，為弱耐鹽種質，占供試材料的62.5%。結果與各種質平均隸屬函數(shù)值反映的耐鹽能力一致。

圖1 豆梨種質聚類分析圖

3 討論

鹽脅迫對豆梨種子的萌發(fā)有抑制作用，且隨著鹽濃度的升高，抑制作用越強，種子萌發(fā)和生長也越困難。但有的植物在低鹽濃度時，能夠促進萌發(fā)[20]或者生長，萌發(fā)不受影響[21-22]。本研究中‘紅塔’種子在不同濃度NaCl脅迫時，生長均受到顯著抑制，說明豆梨種子在萌發(fā)期對NaCl溶液處理比較敏感，鹽脅迫導致滲透脅迫和離子毒害，進而影響種子的萌發(fā)和生長。

種子萌發(fā)的耐鹽性評價指標，主要有發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、胚根長、胚芽長、苗鮮質量等，為綜合評價種子耐鹽性，往往采用其中多個指標的隸屬函數(shù)法進行耐鹽評價。李培英等[23]研究發(fā)現(xiàn)，偃麥草種子萌發(fā)后的鮮質量，與鹽濃度間無相關關系；朱建峰等[17]認為，非鹽生植物適宜選取根長、芽長等生長指標，鹽生植物適宜選取發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等萌發(fā)指標。本研究選取了發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚根長、胚芽長4個指標進行聚類分析，以各指標的隸屬函數(shù)值和各種質隸屬函數(shù)均值為依據，評價種質的耐鹽萌發(fā)能力；根據各指標值，依據歐氏距離，采用離差平方和法進行了聚類分析；將8份種質的耐鹽性劃分三類，結果與各種質4項指標平均隸屬函數(shù)值反映的耐鹽能力一致。

鹽脅迫時，種子的發(fā)芽率受其耐鹽性和種子活力的影響[20]，在正常條件下發(fā)芽率高的種子在鹽脅迫時的發(fā)芽率也高。生活力的測定結果發(fā)現(xiàn)，各種質種子生活力差異不顯著(見表1)，故本研究只采用濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理供試的8份豆梨種子，未進行清水對照的設定。一方面，本研究選用的豆梨種子，是經過沙藏層積，解除休眠后的種子，其已經充分吸脹，飽滿且發(fā)育良好，鹽脅迫后耐鹽萌發(fā)能力能夠說明該種質的萌發(fā)期耐鹽性；另一方面，野生種質采集過程中，當材料種量較少，為節(jié)省種子用量，可直接選擇濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理，測定種子的耐鹽萌發(fā)；第三，在進行大量種質種子耐鹽性比較時，也可實現(xiàn)快速測定。通過‘紅塔’種子在不同濃度鹽處理時的萌發(fā)情況可知，濃度為200 mmol/L的NaCl溶液處理為篩選豆梨種子耐鹽性的關鍵濃度節(jié)點，也是檢測豆梨耐鹽性的閾值，這個鹽處理的濃度與多種植物的耐鹽閾值相吻合[15，22-23]。

種子萌發(fā)期的耐鹽能力，在一定程度上可以反映種子的耐鹽性，可以作為早期鑒定種質耐鹽性的一個方法。種子的萌發(fā)還受到溫度、水分及種子儲藏物質等條件的影響。萌發(fā)期的耐鹽性，有時與生長期的耐鹽性并不完全一致，萌發(fā)期種子胚根的生長受根尖生長點分裂速度的影響，當外界條件不利于根尖細胞生長時，萌發(fā)受到抑制；而鹽脅迫對植株生長期的影響，包含對地下部根和地上部植株兩部分的影響，當高鹽脅迫發(fā)生時，離子富集產生離子毒害，并引起體內營養(yǎng)水平失衡，而造成地上部的幼苗生長受到抑制，此時地下部根為了躲避鹽脅迫，會通過伸長生長和吸水來減少脅迫傷害。本研究會在后續(xù)繼續(xù)觀測幼苗的耐鹽生長，進而對比幼苗期耐鹽能力的不同，探究萌發(fā)期與幼苗期耐鹽性的異同。

4 結論

本研究確定了處理豆梨種子的NaCl溶液濃度閾值為200 mmol/L，可應用于材料稀缺和種質數(shù)量大的耐鹽萌發(fā)快速測定。

豆梨種子萌發(fā)對NaCl溶液處理敏感，隨著濃度增加種子萌發(fā)受到顯著抑制，本研究將8份豆梨種質劃分為高耐鹽(M15)、中度耐鹽(J8、M6)、鹽敏感(SD、M24、M13、J10、J2)3種類型。