微透析探針回收率探討及提高脂溶性藥物回收率的方法

蔡俊飛，范 曉，李亶燁，張 昆，馬云淑*

(1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院，昆明 650500；2.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術研究重點實驗室，昆明 650500)

微透析技術是一種用于分析體內(nèi)細胞外液中生化物質(zhì)的采樣技術[1]，具有連續(xù)取樣、動態(tài)觀察、定量分析、采樣量小和組織損傷輕等特點[2]。1972 年 Delgado J M等[3-5]發(fā)明了微透析探針，人們將其應用在腦微透析的神經(jīng)科學領域。隨著微透析技術的發(fā)展和各種檢測技術的不斷更新，微透析技術的應用范圍進一步擴大。目前，微透析技術被廣泛用于藥物在體內(nèi)、靶器官和靶組織中的藥動學研究[6]。

1 影響微透析探針回收率的因素

微透析技術取樣時，藥物順濃度梯度沿著探針的半透膜進入灌流液中，然后被連續(xù)灌流的灌流液帶出，最終進入收集器中。由于微透析取樣的連續(xù)性，灌流液流經(jīng)半透膜有效部位的時間很短，所以體系處于非平衡狀態(tài)，藥物在半透膜兩側的交換并不完全，收集到的透析液中化合物濃度只是探針周圍樣品實際濃度的一部分，并非靶器官或組織內(nèi)該成分的真實含量，因此需要通過回收率的校正。

微透析回收率是指從灌流液中流出的待測組分與對照品溶液的濃度之比。影響探針回收率的因素很多，主要包括半透膜長度、灌流液流速、灌流液成分、攪拌速度、藥物質(zhì)量濃度、探針使用次數(shù)、探針植入時間、灌流液的pH值、溫度和探針類型等。

1.1半透膜長度 微透析探針膜越長，膜表面積就越大。根據(jù) Ficks 擴散定律，膜表面積越大擴散速度越快，回收率越高[7]。吳黎莉等[8]研究微透析探針膜長度對醋酸曲安奈德回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)，相同條件下CMA30探針(膜長10 mm)比CMA20(膜長 4 mm)回收率高。徐宇琦等[9]研究微透析探針膜長對京尼平苷回收率的影響。結果顯示，膜長為10、15 mm時，探針的回收率分別為34.32%±1.35%、42.97%±0.93%，表明微透析探針的回收率隨探針膜長的增加而增大。

微透析探針體內(nèi)回收率通常較低，加上檢測儀器靈敏度的限制，為了提高實驗結果的準確性，在實驗過程中通常需要選擇膜長較長的微透析探針提高探針的回收率。探針膜長的選擇需要根據(jù)取樣部位確定，較均一的組織(如皮膚、血液等)應選用膜較長的探針，這樣可以提高探針的回收率。但在腦、關節(jié)等精細部位，采用膜太長的探針不方便定位，且容易損壞探針，所以需要選用膜較短的探針。

1.2灌流液流速 微透析取樣時，灌流液的流速通常為0.5～3 μL·min-1。通常灌流液流速越慢，探針回收率越高；流速越快，回收率越低。陳騰飛等[10]把微透析探針植入大鼠腦、頸靜脈，分別以 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 μL·min-1的流速灌流梔子苷溶液。結果發(fā)現(xiàn)，灌流速度為0.5～3.0 μL·min-1時，隨著灌流速度的增加，微透析探針對梔子苷的回收率逐漸降低。

實驗中應根據(jù)具體情況，如透析液中藥物濃度、檢測儀器的靈敏度和檢測方法等選擇合適的灌流速度。如果透析液中藥物濃度較高，在保證藥物能被檢測到的前提下可適當增加灌流速度；如果透析液中藥物濃度較低，在保證收集到的樣品量能夠用于檢測的前提下可適當降低灌流速度。

1.3灌流液成分 在選擇微透析灌流液時，為了減少灌流液對待測組織和待測物的影響，灌流液通常選用接近細胞外液的林格氏液或磷酸鹽緩沖液(PBS)。但灌流液中含有 K+、Ca2+和 Mg2+等，這些離子可顯著影響多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及其代謝物的濃度，從而影響探針的回收率[7]。詹淑玉等[11]采用等滲氯化鈉溶液、林格氏液、PBS和葡萄糖溶液作為灌流液，研究不同灌流液對葛根素回收率的影響。結果發(fā)現(xiàn)，以上述4種溶液為灌流液時探針的回收率分別為71.25%±2.36%、73.48%±1.41%、68.50%±2.43%、74.98%±1.16%，說明灌流液成分會影響探針對葛根素的回收率。吳麗穎等[12]采用含體積分數(shù)為0.1%甲酸和不含甲酸的葡萄糖溶液作為灌流液測定氯己定的體外回收率。結果發(fā)現(xiàn)，含體積分數(shù)為0.1%甲酸的葡萄糖溶液和不含甲酸的葡萄糖溶液作為灌流液時，回收率分別為29.9%、18.7%。說明在灌流液中添加體積分數(shù)為0.1%的甲酸能明顯提高探針的回收率。

1.4攪拌速度 微透析體外實驗中，為了得到穩(wěn)定的探針回收率，往往把探針置于充分攪拌的介質(zhì)中，消除對流引起的濃度邊界效應從而影響藥物的傳質(zhì)阻力，使微透析探針回收率穩(wěn)定[13]。詹淑玉等[11]以林格氏液為灌流液，采用0、100、150、200、250、300 r·min-1的轉速攪拌灌流液，測定葛根素體外回收率，結果發(fā)現(xiàn)，探針體外回收率隨著攪拌速度的增大而增大，當攪拌速度達到200 r·mim-1時，探針的回收率穩(wěn)定在70%左右。

1.5藥物質(zhì)量濃度 在微透析體內(nèi)實驗中，取樣時間較長，藥物質(zhì)量濃度處于隨時變化的狀態(tài)，為確保微透析所得的藥物質(zhì)量濃度能準確反映待測部位的實際藥物質(zhì)量濃度，需要測定不同藥物質(zhì)量濃度下探針的回收率，考察藥物質(zhì)量濃度是否會影響探針的回收率。許小建等[14]研究不同質(zhì)量濃度的左氧氟沙星對微透析探針回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度(1、8、40 μg·mL-1)的左氧氟沙星在微透析探針中的回收率分別為58.81%±2.20%、58.74%±1.59%、60.10%±3.51%，說明藥物質(zhì)量濃度對微透析探針回收率幾乎無影響。徐宇琦等[9]采用林格氏液為灌流液，研究不同質(zhì)量濃度的京尼平苷(2.5、5.0、10.0 μg·mL-1)對微透析探針回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)，探針回收率與京尼平苷質(zhì)量濃度無關。

1.6探針使用次數(shù) 微透析探針較貴，為減少實驗成本，新探針使用后通常不會丟棄，而是清洗后保存在純水中下次繼續(xù)使用。因此需要測定探針使用后的回收率，考察探針使用后回收率是否會發(fā)生改變。陳騰飛等[15]以人參皂苷Rg1為檢測藥物，采用正透析法分別測定新探針、使用過1次和使用過2次的腦、血微透析探針回收率，結果顯示，使用過1次和使用過2次并經(jīng)過處理的探針與新探針相比，回收率無明顯變化。說明在探針使用后，用20 g·L-1的肝素鈉溶液、超純水灌流沖洗處理，能夠維持探針半透膜的通透性。陳騰飛等[16]采用增量法對新探針、使用過1次和使用過2次并經(jīng)過恢復處理的探針進行體外回收率實驗，結果顯示，使用過1次和2次并經(jīng)過恢復處理后的腦、血探針對黃芩苷的回收率與新探針相比，無明顯變化。

1.7探針植入時間 微透析實驗中，取樣時間通常較長，因此，需要考察探針植入動物體內(nèi)一段時間后回收率的穩(wěn)定性。郭麗蓉等[17]把微透析探針植入大鼠皮下，連續(xù)取樣10 h，測定烏頭堿在探針中的回收率，結果發(fā)現(xiàn)，烏頭堿在大鼠體內(nèi)的回收率10 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定，說明探針植入時間不影響探針的回收率。劉楊等[18]把微透析探針植入大鼠海馬與腦，連續(xù)取樣9 h，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定人參皂苷Rg1在探針中的回收率，結果表明，人參皂苷Rg1在大鼠體內(nèi)的回收率9 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

1.8灌流液的pH值 微透析灌流液的pH值對探針回收率的影響主要表現(xiàn)在2個方面：首先是導致探針膜結構的改變，從而影響藥物順濃度梯度的跨膜運動；其次是影響藥物在灌流液中的溶解度和穩(wěn)定性。唐紅艷等[19]以不同pH值的PBS為灌流液，采用增量法測定雪上一枝蒿甲素在微透析探針中的回收率，結果發(fā)現(xiàn)，以pH值為 6.5、7.4、8.5的PBS為灌流液時，雪上一枝蒿甲素的回收率分別為34.4%±8.31%、71.8%±1.71%、67.1%±1.24%，表明灌流液的pH值對雪上一枝蒿甲素在微透析探針中的回收率影響較大。

1.9溫度 溫度升高，分子熱運動加快，藥物擴散速度加快，微透析探針回收率增大。孟英姣等[20]采用林格氏液和人工腦脊液為灌流液，研究不同溫度(25、30、37、42 ℃)對芒柄花素、芍藥苷在血、腦微透析探針中的回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)，芒柄花素和芍藥苷在微透析探針中的回收率會隨著溫度的升高而增大。廖衛(wèi)國等[21]研究不同溫度(25、30、37、42 ℃)對阿魏酸、川芎嗪在微透析探針中的回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，隨著溫度升高，阿魏酸和川芎嗪在腦微透析探針中的回收率增大。鄧顯儀等[22]研究不同溫度(25、37、45 ℃)對雪上一枝蒿甲素在微透析探針中的回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)，溫度對探針的回收率有較大的影響，溫度升高探針回收率增大。因此，微透析體內(nèi)實驗時，需要保持動物體溫穩(wěn)定，從而提高探針回收率的穩(wěn)定性，保證實驗結果準確可靠。

1.10探針類型 微透析探針形式多樣，按其幾何構造可分為同心圓形探針、線性探針、柔性探針和分流探針。不同類型的探針適用于不同部位取樣，回收率也會不同。張巖等[23]采用林格氏液為灌流液，研究氧化苦參堿在同心圓形探針和線性探針中的回收率，結果發(fā)現(xiàn)，相同條件下同心圓形探針的回收率明顯高于線性探針的回收率。

2 提高脂溶性藥物回收率的方法

微透析實驗中，通常采用降低灌流液流速、選擇合適的探針和灌流液等方法提高探針的回收率。但由于脂溶性藥物在水溶性灌流液中溶解度低的特性，加上實驗條件和檢測手段的限制，實驗過程中，通常采用改變灌流液的成分和pH值等來提高脂溶性藥物在探針中的回收率。

目前，微透析實驗常用的灌流液有林格氏液、人工腦脊液、PBS和檸檬酸-葡萄糖溶液[24]等。這些灌流液大多屬于水溶性溶液，探針對水溶性藥物回收率較高。但使用水溶性灌流液很難較好地溶解脂溶性藥物，會導致探針回收率低、檢測困難和實驗誤差大[25]。此外，微透析探針對脂溶性成分具有一定的吸附性，也會導致探針回收率降低[26]。

2.1改變灌流液的成分 研究發(fā)現(xiàn)，向常用灌流液中加入灌流液改性劑，如環(huán)糊精、乙醇、脂肪乳、牛血清白蛋白、抗體或其他親和物質(zhì)能一定程度上消除脂溶性藥物與微透析探針膜的結合或增加藥物在灌流液中的溶解度，從而提高脂溶性藥物在探針中的回收率。

2.1.1加入助溶劑 灌流液中加入環(huán)糊精(α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精)等助溶劑可以與脂溶性藥物形成水溶性復合物，消除脂溶性藥物與探針膜的結合，從而增加脂溶性藥物在探針中的回收率[27]。Khramov A N等[28]研究發(fā)現(xiàn)，向微透析灌流液中添加助溶劑環(huán)糊精(β環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精等)后，環(huán)糊精可以與藥物形成絡合物，加快藥物透過探針透析膜的速度，從而提高脂溶性藥物(丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、卡馬西平和異丙嗪)在微透析探針中的回收率。Fletcher H J等[29]研究腦啡肽在微透析探針中的回收率，結果發(fā)現(xiàn)，在灌流液中添加助溶劑環(huán)糊精可將腦啡肽的回收率提高2倍。

2.1.2加入潛溶劑 脂溶性藥物在水溶性灌流液中的溶解度較低，導致藥物在微透析探針中的回收率偏低，加入乙醇等潛溶劑可增加脂溶性藥物在灌流液中的溶解度，從而提高藥物在探針中的回收率。因此，可通過向常用灌流液中添加適當比例的乙醇從而增大藥物在微透析探針中的回收率。管詠梅等[30]以乙醇體積分數(shù)為30%的生理鹽水溶液、林格氏液和PBS為灌流液，采用LC-MS/MS法研究雷公藤甲素在微透析探針中的回收率。結果顯示，以上述3種溶液為灌流液時，雷公藤甲素在微透析探針中的回收率分別為43.79%±5.53%、38.39%±2.46%、32.50%±1.76%，說明以乙醇體積分數(shù)為30%的生理鹽水溶液為灌流液時雷公藤甲素在微透析探針中的回收率最高。劉新國等[31]考察灌流液改性劑對環(huán)維黃楊星 D在微透析探針中的回收率的影響，結果發(fā)現(xiàn)，以乙醇體積分數(shù)為30%的生理鹽水溶液為灌流液時環(huán)維黃楊星 D的回收率最高，且回收率較穩(wěn)定。

2.1.3加入增溶劑 水包油微乳液作為一種增溶劑，被廣泛用于提高脂溶性藥物的溶解度[32]，從而提高脂溶性藥物在微透析探針中的回收率。水包油型微乳液為液態(tài)，液滴外的脂溶性分子可以通過油水界面擴散進入液滴內(nèi)的油相核心，從而提高疏水性藥物的溶解度[33]。由于水包油型微乳具有提高脂溶性藥物溶解度的特點，適合用作微透析灌流液，并能增大脂溶性藥物的回收率。Zhang Yong Tai等[34]采用聚氧乙烯蓖麻油和二乙二醇單乙基醚作為表面活性劑和助表面活性劑，以油酸乙酯為油相制備成微乳，將微乳與林格氏液按1∶6的比例混合，獲得等滲溶液。實驗結果表明，以這種溶液為灌流液時脂溶性化合物吳茱萸堿和吳茱萸次堿的回收率分別為58.36%±0.57%、49.40%±0.57%，高于以聚乙二醇(PEG)400體積分數(shù)為20%的林格氏液和乙醇體積分數(shù)為10%的林格氏液為灌流液時的回收率。Gao Qizhen等[35]研究發(fā)現(xiàn)，糠酸莫米松在含PEG400體積分數(shù)為40%、含脂肪乳體積分數(shù)為5%、20%林格氏液中的溶解度明顯高于在林格氏液中的溶解度。同時，與含脂肪乳體積分數(shù)為40%、20%林格氏液相比，含脂肪乳體積分數(shù)為5%的林格氏液中糠酸莫米松的回收率和傳遞率均明顯提高，且回收率與傳遞率相等。

2.1.4加入滲透劑 高相對分子質(zhì)量截留膜的微透析探針可用于相對分子質(zhì)量大的化合物(如生物活性肽和蛋白質(zhì))取樣。但較高相對分子質(zhì)量截留膜中液體容易流失，從而影響分析物的回收率。研究發(fā)現(xiàn)，滲透劑如牛血清白蛋白可以降低微透析探針膜的失水能力，顯著提高分析物在探針中的回收率。吳黎莉等[8]以PBS、脂肪乳、含 50 g·L-1羥丙基-β-環(huán)糊精及含不同質(zhì)量濃度牛血清白蛋白(5、10、20 g·L-1)的PBS為灌流液，研究醋酸曲安奈德在微透析探針中的回收率，結果發(fā)現(xiàn)，以PBS中添加 10、20 g·L-1牛血清白蛋白的溶液為灌流液時，醋酸曲安奈德在探針中的回收率得到較大提高，且回收率和傳遞率相等。

2.1.5加入親和物質(zhì) 在微透析取樣過程中，由于蛋白質(zhì)和肽具有疏水性，導致相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和肽等物質(zhì)在微透析探針中的回收率較低。在灌流液中加入抗體、肝素等親和物質(zhì)能提高其在探針中的回收率。Ao Xiaoping等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在微透析灌流液中加入抗體包被的微球增加了透析膜中分析物的擴散驅動力，從而使腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)和白細胞介素-5(IL-5)在微透析探針中的回收率提高4～12 倍。Herbaugh Anthony W等[37]研究發(fā)現(xiàn)，灌流液中添加單克隆抗體后，灌流液流速為2.0、1.0 μL·min-1時，趨化因子配體2在探針中的回收率從9.6%±3.4%、12.2%±4.1%提高到37.5%±10.2%、64.8%±11.7%，說明在灌注液中添加游離抗體會增加趨化因子配體2的回收率。Duo Jia等[38]研究發(fā)現(xiàn)，向微透析灌流液中加入肝素包被的微球作為親和劑后，酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、單核細胞趨化蛋白-1(CCL2)和正常T細胞表達和分泌因子(CCL5)在微透析探針中的回收率提高2～5倍。

目前，常用的灌流液改性劑，如環(huán)糊精、乙醇、脂肪乳、牛血清白蛋白、抗體或其他親和物質(zhì)均能在一定程度上消除脂溶性藥物與微透析探針膜的結合或增加藥物在灌流液中的溶解度，從而提高脂溶性藥物在探針中的回收率。但對于某些藥物而言，并非所有的灌流液改性劑都能提高其在探針中的回收率。因此，在微透析實驗中，應根據(jù)實驗藥物選擇能使其回收率提高的灌流液改性劑。

2.2改變灌流液的pH值 微透析灌流液的pH值可影響藥物在灌流液中的溶解度及穩(wěn)定性，從而影響藥物在探針中的回收率。因此，可以采用改變灌流液pH值的方法來提高脂溶性藥物在微透析探針中的回收率。Tre Emmanuelle S等[39]研究優(yōu)化灌流液的 pH 值提高脂溶性藥物在探針中的回收率。結果發(fā)現(xiàn)，酮康唑、克霉唑和維甲酸為脂溶性藥物，在生理pH(7.4)條件下溶解度較低，導致它們在探針中的回收率較低。采用pH值為4的灌流液時，酮康唑和克霉唑的回收率分別提高6.9、8.3倍，采用pH值為9的灌流液時，維甲酸的回收率提高2倍。說明對于脂溶性藥物，微透析探針回收率較低，可以采用改變灌流液pH值的方法提高探針的回收率。

3 總結與展望

與傳統(tǒng)的取樣技術相比，微透析技術作為一種新型活體取樣技術具有以下優(yōu)點：(1)可以在不干擾機體正常生命活動的情況下進行在體、實時、在線取樣；(2)既可對同一組織進行長時間連續(xù)取樣，又可對同一動物進行多個部位取樣，減少實驗動物數(shù)量，同時也避免實驗動物的個體差異造成的實驗誤差；(3)采樣量小、組織損傷輕，所得數(shù)據(jù)準確可靠；(4)微透析樣品干凈，不需要前處理，可以直接進行樣品分析；(5)可以直接測定生物體內(nèi)游離態(tài)藥物質(zhì)量濃度；(6)可與多種分析儀器聯(lián)用[40-42]，實現(xiàn)在線分析，易于自動化。因此，微透析技術在藥學研究中顯示出巨大的優(yōu)勢。隨著微透析技術和現(xiàn)代檢測技術的發(fā)展，微透析技術越來越多地被應用于腦部[43]、眼部[44]、血液[45]、肌肉[46]、皮膚[47]、肝臟[48]、腫瘤[49]、關節(jié)[50]、膽[51]及肺[52]等部位的藥動學、藥效學、藥動學-藥效學結合模型中。

微透析技術在藥學研究中也存在一定的局限性：(1)藥動學實驗通常需要通過探針的體內(nèi)回收率計算藥物在體內(nèi)的實際質(zhì)量濃度。但由于藥物在動物體內(nèi)的質(zhì)量濃度未知，只能測定探針傳遞率，然后用傳遞率推測探針回收率。對于一種化合物而言，傳遞率和回收率并不總是相等的。因此，如何解決探針傳遞率和回收率不相等的問題成為微透析技術在藥動學研究中的重點。(2)微透析實驗常用灌流液(如生理鹽水、林格氏液、PBS、人工腦脊液等)大多屬于水溶性溶液，對脂溶性強的藥物回收率較低。所以，在進行脂溶性藥物微透析實驗時，如何選擇合適的灌流液，提高探針回收率，確保實驗數(shù)據(jù)準確可靠，成為人們需要研究的問題。(3)由于微透析技術取樣的連續(xù)性，探針回收率較低，對檢測儀器要求較高。常用的檢測儀器(如高效液相色譜儀等)靈敏度較低，可能導致實驗數(shù)據(jù)不準確甚至檢測不到透析液中的藥物，需要靈敏度更高的儀器(如 LC-MS/MS等)才能用于透析液樣品的檢測。但這些靈敏度高的儀器通常價格較貴，而且使用和維護成本較高。因此，如何提高探針回收率，減少實驗成本，成為未來微透析技術研究的重點。相信隨著科學技術的不斷發(fā)展，這些問題將會被解決。