超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的研究進展

鐘林宏 祝興宇 張 渝 楊遠梅 陳東鴻 王玉琦 云旦次仁 李 攀

血腦屏障是保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定的特殊解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，其確保了腦正常生理功能，對腦組織有較好的保護作用，但也會阻礙藥物進入顱內(nèi)，不能在腦組織中達到有效濃度，從而影響對腦部疾病的治療效果［1］。開放血腦屏障并增強其對藥物的通透性能較好地解決上述問題。常見血腦屏障開放方法包括：①開顱進行腦室穿刺，但手術(shù)感染風(fēng)險大且危險性高；②對藥物進行脂溶性化學(xué)修飾，但會減少藥物的利用度，難以達到藥物有效濃度且副作用大［2］。因此，如何安全、高效地開放血腦屏障，使藥物能在顱內(nèi)局部達到有效濃度，是目前研究的重點。超聲是一種可控的實現(xiàn)血腦屏障開放的有效方法，在微泡定位下具有提高顱內(nèi)局部藥物濃度的潛在能力。超聲靶向微泡破壞（UTMD）技術(shù)可暫時增加超聲聚焦區(qū)域的血管通透性，介導(dǎo)藥物高效靶向運輸至腦部病灶區(qū)域，增加腦部特定區(qū)域的藥物濃度［3］。該方法可以實現(xiàn)相對有效的局部治療，不會引起嚴重的神經(jīng)元損傷，在腦部疾病治療領(lǐng)域具有廣闊的研究前景。但超聲強度、輻射時間、微泡材料及劑量大小等均會影響血腦屏障開放的程度及安全性［4］。本文就超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的方法、安全性評估及防控對策進行綜述。

一、超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的方法

1.高強度聚焦超聲（HIFU）聯(lián)合微泡開放血腦屏障：HIFU的熱效應(yīng)使腦局部組織的溫度升高，促進緊密連接復(fù)合體蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白變性，增加血腦屏障的通透性，以實現(xiàn)血腦屏障的選擇性開放。在腦腫瘤的治療方面，HIFU 聯(lián)合微泡傳遞化療藥物能使腦腫瘤內(nèi)的藥物濃度上升，抑制腫瘤生長，從而延長實驗動物的生存期［5］。在阿爾茲海默癥的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，HIFU聯(lián)合微泡可減少β-淀粉樣斑塊負荷，延緩tau蛋白的磷酸化趨勢，有效改善小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)［6］，表明HIFU 聯(lián)合微泡對神經(jīng)疾病具有一定的治療效果。動物研究和臨床試驗［7］證實，HIFU 聯(lián)合微泡開放血腦屏障可以有效治療腦部疾病，能廣泛應(yīng)用于運動障礙病、精神病、腦腫瘤和阿爾茲海默癥的治療，以及減輕神經(jīng)病理性疼痛。

2.診斷超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障：劉平等［8］使用診斷超聲（頻率1.7 MHz，機械指數(shù)1.3）經(jīng)大鼠尾靜脈注入不同劑量的自制脂質(zhì)體超聲造影劑，經(jīng)顱超聲輻照10 min，隨著超聲造影劑劑量增加，反映血腦屏障滲透性大小的伊文思藍染液在腦組織的滲出量也不斷增多，其分布與輻照方向一致，滲出區(qū)域也局限于超聲輻照部位，表明在診斷超聲作用下微泡造影劑能夠增加血腦屏障的通透性。Xie等［9］使用經(jīng)顱多普勒（頻率1 MHz）聯(lián)合微泡使豬血腦屏障的通透性增高，效果與單獨通過靜脈注入微泡的作用相同，經(jīng)超聲輻照120 min 后血腦屏障恢復(fù)其原有功能，說明血腦屏障在診斷超聲聯(lián)合微泡或單獨使用微泡作用下保持開放 2 h 后關(guān)閉。而 Mesiwala 等［10］研究顯示，HIFU 開放的血腦屏障在超聲處理后72 h內(nèi)關(guān)閉，且在血腦屏障開口區(qū)域會出現(xiàn)小范圍的腦組織損傷。因此，在保持較低峰值負壓的條件下，診斷超聲聯(lián)合微泡較HIFU 聯(lián)合微泡能更安全地實現(xiàn)血腦屏障的可逆性開放，提高血腦屏障對藥物的轉(zhuǎn)運作用。

3.低頻超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障：相較于HIFU 與高壓力診斷超聲對周圍正常腦組織的損害風(fēng)險，低頻超聲的吸收系數(shù)小，組織損傷小，熱效應(yīng)和腦局部組織的溫度升高程度可忽略不計。因此，低頻超聲結(jié)合微泡能更安全、快速地誘使血腦屏障的開放，促進生物大分子的吸收。此外，低頻超聲與微泡介導(dǎo)的靶向基因治療相結(jié)合，不僅可以增強裸質(zhì)粒DNA在癌細胞中的轉(zhuǎn)染和表達，還可以提高基因治療的靶向性，減少全身性副作用。程遠等［11］經(jīng)大鼠尾靜脈注射微泡（0.5 ml/kg），同時使用43 kHz的低頻超聲持續(xù)輻照大鼠頭頂部區(qū)域，10 min 后光鏡觀察到超聲輻照區(qū)域出現(xiàn)輕微的腦組織水腫，24 h 內(nèi)基本恢復(fù)，無明顯的腦實質(zhì)損害；電鏡鑭示蹤法發(fā)現(xiàn)輻照區(qū)鑭離子通過內(nèi)皮細胞、基底膜及神經(jīng)膠質(zhì)細胞，說明在低頻超聲聯(lián)合微泡作用下超聲輻照部位的血腦屏障通透性增加，處于開放狀態(tài)，而輕微的腦水腫形成可能為超聲作用下微泡的空化效應(yīng)使內(nèi)皮細胞間的緊密連接先撐寬后恢復(fù)，表明血腦屏障先開放后關(guān)閉；透射電鏡可觀察到血管結(jié)構(gòu)完整，緊密連接加寬，吞飲小泡增多，可見內(nèi)皮細胞間的微孔，但并未出現(xiàn)腦組織損傷，說明在低頻超聲的作用下，微泡發(fā)生空化效應(yīng)撐開緊密連接，能無損傷、可逆性地開放血腦屏障。

二、超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的安全性評估

1.MRI：可作超聲聯(lián)合微泡處理后評估顱內(nèi)特定區(qū)域損傷程度的檢測手段，T2 加權(quán)（T2WI）成像可以提供細微的解剖結(jié)構(gòu)信息，T2WI 成像上的低強度信號可提示含鐵血黃素或紅細胞外滲，以此反映超聲聯(lián)合微泡作用對脈管系統(tǒng)造成的損傷，高強度信號可提示腦水腫的形成［12］；而T1 加權(quán)（T1WI）成像則可以顯示超聲聯(lián)合微泡處理后血腦屏障通透性的改變，目標(biāo)區(qū)域信號強度的增加表示血腦屏障通透性增強［13］，同時T1WI 成像可用于研究超聲處理后血腦屏障開放的持續(xù)時間，也可以通過T2WI 或磁敏感加權(quán)MRI 序列檢測腦微出血的情況，但這些序列對檢測分散或不連續(xù)的紅細胞外滲能力有一定局限［14］。

2.組織學(xué)檢查：組織學(xué)檢查較MRI 具有更高的敏感性，可以通過HE染色觀察紅細胞外滲區(qū)來反映超聲聯(lián)合微泡作用對脈管系統(tǒng)造成的損傷，壞死細胞、凋亡細胞和空泡的存在也可以通過HE 染色或其他標(biāo)記物進行評估［15］。TUNEL 染色可以觀察到凋亡小體的存在，而普魯士藍染色能夠反映含鐵血黃素的沉積。此外，伊文思藍和臺盼藍兩種染液因其在生理狀態(tài)下均無法正常通過血腦屏障，常被用于測定血腦屏障的通透性變化，以及超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的實驗研究。伊文思藍染液滲出量隨血腦屏障通透性的增加而增加，通過分光光度計檢測腦組織中的染液含量，能夠作為判斷血腦屏障開放程度的一種定量指標(biāo)［16］。

三、超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的安全性防控

1.超聲強度和換能器頻率：換能器頻率、超聲強度和峰值負壓均會影響血腦屏障破壞的程度及其安全性。一項對大鼠神經(jīng)腫瘤模型的實驗［17］發(fā)現(xiàn)，在1.0 MHz的換能器頻率作用下，0.3~0.5 MPa 的超聲強度會引起超聲輻照腦區(qū)域的分散或不連續(xù)的紅細胞外滲，超過1.5 MPa 則會引起輻照區(qū)域的紅細胞連續(xù)外滲或微出血；而在1.5 MHz 的頻率作用下，2.4 MPa 的超聲強度會對輻照區(qū)域造成壞死性損傷或大出血伴細胞凋亡。有研究［18］發(fā)現(xiàn)，高強度峰值負壓超聲處理會對脈管系統(tǒng)和腦實質(zhì)造成一定程度的損害，超聲波峰值負壓為0.6 MPa，驅(qū)動頻率為0.69 MHz 的HIFU 聯(lián)合微泡處理4 h 后，可見少量紅細胞外滲，而在0.8 MPa 的峰值負壓作用下紅細胞外滲的數(shù)量和大小均顯著增加。此外，有研究［19］發(fā)現(xiàn)空化效應(yīng)與超聲頻率成反比，相對空化值的增加取決于超聲頻率的減小，在低頻超聲作用下微泡造影劑更容易發(fā)生空化效應(yīng)。研究［18］也表明超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障后導(dǎo)致的微出血不僅可以避免，還能夠在較低的超聲功率下實現(xiàn)血腦屏障的開放，而且血腦屏障在較低壓力和較低換能器頻率下更容易被破壞。隨著超聲頻率的增加，腦組織的衰減程度也在不斷上升，可能導(dǎo)致顱骨熱量增加而加重組織的熱損傷，促使超聲焦點的扭曲變形。

2.輻照時間和炎癥反應(yīng)：隨著超聲輻照時間的改變，HIFU聯(lián)合微泡介導(dǎo)的血腦屏障開放會對腦組織造成不同程度的炎癥反應(yīng)。通過星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（Gfap）及離子化鈣結(jié)合適配器分子1（Iba1）表達水平的變化可以反映超聲干預(yù)后腦局部炎癥的發(fā)展過程。一項對野生型小鼠的實驗［19］發(fā)現(xiàn)，相對于非超聲處理的對側(cè)皮層，經(jīng)超聲處理4 h和4 d后腦皮層中Iba1的表達水平發(fā)生了上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但15 d 后兩側(cè)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而Gfap的表達水平在HIFU聯(lián)合微泡處理4 d后發(fā)生了上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但4 h 及15 d 后比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。表明HIFU 聯(lián)合微泡介導(dǎo)的血腦屏障開放可以在一定程度上促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞的短暫活化，且根據(jù)輻照時間的不同，膠質(zhì)細胞的激活時間也會發(fā)生改變，但大多在2周內(nèi)恢復(fù)正常。分離HIFU 處理后的腦微血管可以發(fā)現(xiàn)，超聲輻照6 h后Ccl2、Ccl3、Ccl7、C3、Illb、Il6、Sele 等與急性炎癥發(fā)生有關(guān)的基因表達均上調(diào)，在一定程度上反映了Mcp1、Icam1、Tnfa 和Mmp9 等炎癥反應(yīng)蛋白水平的升高，一直持續(xù)到輻照后24 h 上述基因的表達才恢復(fù)到正常基線水平［20］。另外，與急性炎癥發(fā)生有關(guān)的Tnf、Icam1、Ccl5、Illb基因表達水平均與血腦屏障通透性的變化程度有關(guān)［21］。

3.微泡材料和劑量：研究［22］發(fā)現(xiàn)，空化閾值隨微泡劑量的減少而增加，較大的微泡劑量更容易引起空化效應(yīng)，從而加速誘導(dǎo)血腦屏障的開放。而在固定劑量下，較大尺寸的微泡具有更長的循環(huán)時間，但在相同的超聲參數(shù)下，更大尺寸的微泡和更長的有效循環(huán)時間意味著更高的出血風(fēng)險［23］。目前，大多數(shù)新型微泡造影劑的直徑為2~8 μm，與紅細胞相似［24］，經(jīng)外周靜脈快速注射微泡造影劑后，可以通過肺循環(huán)順利進入體循環(huán)。隨著分子成像技術(shù)的飛速發(fā)展，近年出現(xiàn)了納米級超聲造影劑，與微米級微泡相比，其在靶向治療領(lǐng)域上有更好的應(yīng)用潛能。如納米脂質(zhì)體造影劑和納米碳氟乳劑，不僅具有更好的回聲特性，還可以輸送更多的活性分子穿過血腦屏障，降低藥物的分子毒性并提高治療效果［25］。

四、總結(jié)與展望

總之，超聲聯(lián)合微泡治療能可逆性地開放血腦屏障，使藥物能夠靶向遞送至腦組織的特定區(qū)域，提高藥物在顱內(nèi)的局部濃度。今后應(yīng)針對優(yōu)化超聲參數(shù)、增強微泡的靶向性、延長微泡在目標(biāo)區(qū)域的停留時間及有效控制釋放時間進行研究，探討不同超聲參數(shù)下超聲聯(lián)合微泡在不同腦部疾病中的應(yīng)用價值。