周炳鑫，張 雷,2，李顏桃，馬 躍,3,4，曹立亭,3,4*

川續(xù)斷水煎液對小鼠非特異性免疫功能的影響

周炳鑫1，張 雷1,2，李顏桃1，馬 躍1,3,4，曹立亭1,3,4*

(1. 西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2. 畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)農(nóng)牧局，畢節(jié) 551700；3. 西南大學(xué)中獸醫(yī)藥研究所，重慶 402460；4. 重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 402460)

為探討川續(xù)斷水煎液對小鼠非特異性免疫功能的影響。40只昆明系健康小白鼠隨機分為5組，每組8只，分別灌胃不同劑量終濃度為2 g·mL-1的川續(xù)斷水煎液（按體質(zhì)量分別為10、20、30和40 g·kg-1），連續(xù)灌胃7 d，空白對照組灌胃等體積的生理鹽水。通過對給藥前后平均日增重、胸腺脾臟組織病理變化、巨噬細(xì)胞吞噬活性和血清溶血素等指標(biāo)的檢測，評價其對動物機體非特異性免疫功能的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，灌胃川續(xù)斷水煎液后能不同程度地提高試驗各組小鼠平均日增重，各劑量組日增重率分別為9.8％、29.2％、24.4％和24.3％；可顯著提高小鼠脾臟和胸腺指數(shù)（<0.05），對小鼠免疫組織有明顯促進(jìn)作用，脾臟中央動脈周圍淋巴鞘的淋巴細(xì)胞密集，胸腺皮質(zhì)與髓質(zhì)分界清晰且胸腺細(xì)胞增多；極顯著增強小鼠廓清指數(shù)（<0.01），顯著增強吞噬指數(shù)及血清溶血素水平（<0.05）。提示川續(xù)斷水煎液可增強小鼠的非特異性免疫功能。

川續(xù)斷水煎液；小鼠；臟器指數(shù)；廓清指數(shù)；吞噬指數(shù)；血清溶血素；非特異性免疫

川續(xù)斷為川續(xù)斷科（）多年生草本植物川續(xù)斷（）的干燥根，因能“續(xù)折接骨”而得名。川續(xù)斷味苦、辛，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏及安胎等功效，可用于治療肝腎不足所致的腰膝痿軟、風(fēng)濕痹痛以及筋傷骨折、崩漏、胎漏和跌撲損傷等病證?，F(xiàn)代研究表明，川續(xù)斷含有三萜皂苷、生物堿、揮發(fā)油和多糖類等多種化學(xué)成分[1]，其中三萜皂苷具有抗骨質(zhì)疏松、增加骨密度等藥理作用[2]，總生物堿能抑制妊娠大鼠在體子宮平滑肌的收縮活動，并降低收縮幅度和張力[3]，揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌具有抑制作用。除此之外，川續(xù)斷還能對神經(jīng)系統(tǒng)、骨組織以及免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響[4]。然而，對川續(xù)斷在機體免疫功能方面的研究報道較少。因此，本試驗擬將川續(xù)斷水煎液灌胃小鼠，觀察其對機體非特異性免疫功能的影響，為深入探究其免疫作用機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物及主要試劑

川續(xù)斷飲片，購自重慶泰爾森制藥有限公司。豚鼠凍干血清補體，購自北京博爾西科技有限公司；印度墨汁，購自南京都萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗動物

昆明系小鼠，雌雄各半，體重（20 ± 2） g，委托西南大學(xué)榮昌校區(qū)實驗動物平臺統(tǒng)一訂購。

1.3 試驗方法

1.3.1 川續(xù)斷水煎液的制備 采用水煎法，按照1∶5加入提取溶劑進(jìn)行提取，每次提取1 h，合并兩次提取液，最后濃縮至相當(dāng)于生藥量2 g·mL-1的藥液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 試驗設(shè)計及處理 40只昆明系小鼠，雌雄各半，體重（20 ± 2） g，隨機分為5組，即A、B、C、D4個試驗組和對照組。試驗組分別按體質(zhì)量灌胃10 g·kg-1、20 g·kg-1、30 g·kg-1和40 g·kg-1終濃度為2 g·mL-1的川續(xù)斷水煎液，對照組灌胃等量生理鹽水，1 次·d-1，連續(xù)灌胃7 d。

1.3.3 小鼠平均日增重的測定 分別于給藥前1 d、末次給藥后1、7 d早晨空腹稱量各試驗組小鼠體重并記錄，計算小鼠的平均日增重。

1.3.4 免疫器官指數(shù)的測定 末次給藥后7 d脫頸椎處死各試驗組小鼠，摘取胸腺、脾臟，用濾紙吸干血跡以及表面水分后稱重，計算其臟器指數(shù)。

1.3.5 免疫器官組織切片的制備 無菌操作采取各試驗組小鼠胸腺和脾臟組織塊，按照常規(guī)方法制備組織切片，光學(xué)顯微鏡下觀察臟器的組織結(jié)構(gòu)變化情況。

1.3.6 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定[5]于末次給藥后按0.01 mL·g-1體質(zhì)量尾靜脈注射4倍稀釋的印度墨汁，分別于注射后2，10 min用肝素處理的毛細(xì)玻管采集眼眶靜脈血0.04 mL，溶入4 mL 0.1% Na2CO3溶液中，搖勻，然后以0.1% Na2CO3溶液作為空白對照，650 nm處檢測其吸光度值（1和2），計算碳粒廓清指數(shù)（）；準(zhǔn)確摘取小鼠肝臟、脾臟并稱重，計算吞噬指數(shù)α值。

1、2代表先后兩次所測的吸光度，t為體質(zhì)量，g為肝質(zhì)量，p為脾質(zhì)量，1和2分別代表代表2 min和10 min。

1.3.7 小鼠血清溶血素的測定 灌胃給藥7 d后按0.01 mL·g-1體質(zhì)量腹腔注射5%雞紅細(xì)胞（CRBC）懸液，連續(xù)免疫7 d，末次免疫24 h后，眼球取血，室溫靜置2 h，4 ℃ 2 000 r·min-1離心10 min，分離血清，保存?zhèn)溆谩z測前，待檢血清用生理鹽水進(jìn)行100倍稀釋，取稀釋后的血清2 mL與5% CRBC懸液1 mL、10%豚鼠血清補體1 mL混勻。另設(shè)空白對照管（生理鹽水代替血清）作為調(diào)“0”和CRBC半數(shù)溶血管。37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min后轉(zhuǎn)入至0 ℃終止反應(yīng)。3 000 r·min-1離心10 min，取上清于紫外分光光度計540 nm處測光密度值，溶血素值以半數(shù)溶血值HC50表示。

取5% CRBC 0.25 mL加生理鹽水至2 mL， 3 000 r·min-1離心10 min，取上清于540 nm處比色，得到CRBC半數(shù)溶血時的吸光度[6-7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 川續(xù)斷水煎液對小鼠平均日增重的影響

與空白對照組相比，灌胃川續(xù)斷水煎液后均能不同程度地提高試驗小鼠的平均日增重。除10 g·kg-1灌胃劑量組外，其余劑量組平均日增重均顯著升高（<0.05），分別提高29.2%、24.4%和24.3%，但各劑量組之間統(tǒng)計學(xué)比較差異不顯著（>0.05）。詳見圖1。

A. 10 g·kg-1劑量組；B. 20 g·kg-1劑量組；C. 30 g·kg-1劑量組；D. 40 g·kg-1劑量組。

Figure 1 Effect ofdecoction on average daily gain in mice

2.2 川續(xù)斷水煎液對免疫器官指數(shù)的影響

由圖2可知，與空白對照組相比，灌胃川續(xù)斷水煎液后均顯著或極顯著提高試驗小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，分別提高23%、30%、27%、26%和24%、34%、27%、27%，其中以20 g·kg-1灌胃劑量效果最佳（<0.01）。但各劑量組之間比較差異不顯著（＞0.05）。

圖2 川續(xù)斷水煎液灌胃后免疫器官指數(shù)的變化情況

Figure 2 Effect ofdecoction on the indexes of immune organs in mice

2.3 川續(xù)斷水煎液對小鼠免疫器官組織結(jié)構(gòu)影響

2.3.1 對脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響 由圖3可知，與空白對照組相比，灌胃川續(xù)斷水煎液后，小鼠脾臟組織生發(fā)中心和淋巴鞘的淋巴細(xì)胞密集程度明顯增高，其中以20 g·kg-1灌胃劑量效果最明顯。

白色箭頭所示為生發(fā)中心，黑色箭頭所示為淋巴鞘。

Figure 3 The microstructure of spleen tissue in mice（HE, 100×）

白色箭頭是髓質(zhì)，黑色箭頭是皮質(zhì)。

Figure 4 The microstructure of thymus tissue in mice（HE, 100×）

圖5 川續(xù)斷水煎液對小鼠碳粒廓清指數(shù)的影響

Figure 5 Effect ofdecoction on the carbon clearance index in mice

2.3.2 對胸腺組織的影響 由圖4可知，空白對照組小鼠胸腺組織細(xì)胞較稀疏，灌胃川續(xù)斷水煎液后小鼠胸腺的皮質(zhì)與髓質(zhì)分界清楚，皮質(zhì)中胸腺細(xì)胞密集。

2.4 川續(xù)斷水煎液對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能影響

從圖4和圖5可知，灌胃川續(xù)斷水煎液后碳粒廓清指數(shù)（K）均極顯著性升高（<0.01），同時顯著或極顯著升高吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)（<0.05或<0.01），但各劑量組之間統(tǒng)計學(xué)比較差異不顯著。其中以20 g·kg-1灌胃劑量組效果最佳。

圖6 川續(xù)斷水煎液對吞噬指數(shù)的影響

Figure 6 Effect ofdecoction on the phagocytic index in mice

圖7 川續(xù)斷水煎液對小鼠血清溶血素的影響

Figure 7 Effects ofdecoction on serum hemolysin level in mice

2.5 川續(xù)斷水煎液對血清溶血素的影響

與空白對照組相比，灌胃不同劑量川續(xù)斷后血清溶血素含量明顯升高，其中灌胃20 g·kg-1、30 g·kg-1、40 g·kg-1劑量組統(tǒng)計學(xué)比較差異顯著（<0.05）。但各劑量組之間統(tǒng)計學(xué)比較差異不顯著（圖6）。

3 討論

“藥食同源”是中（獸）醫(yī)養(yǎng)生保健的物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥不僅可用于臨床病證的防治，還可以用于調(diào)理機體功能，如促進(jìn)動物生長、增強機體免疫力、提高動物生產(chǎn)能力等。中藥含有多種活性成分如多糖、皂苷、生物堿、黃酮、揮發(fā)油等，不同的有效藥用成分對機體產(chǎn)生不同的藥理作用[8-9]。三萜皂苷是川續(xù)斷中的主要有效成分，具有抗菌、抗炎、保肝以及調(diào)節(jié)機體免疫力的作用。本研究以小鼠為試驗動物探究灌胃川續(xù)斷水煎劑對其生長性能的影響，結(jié)果顯示，灌胃川續(xù)斷水煎液后可明顯提高試驗小鼠的平均日增重，分別提高了9%、29%、24%和22%，其中20 g·kg-1劑量組效果最佳。這可能是川續(xù)斷在煎煮過程中三萜皂苷與多糖形成糖萜 素[10]，從而提高了飼料利用率。

胸腺與脾臟分別是動物機體中樞免疫系統(tǒng)和外周免疫系統(tǒng)的重要器官，胸腺的生理性萎縮最先發(fā)生于皮質(zhì)，皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞減少，皮質(zhì)區(qū)域的大小表明胸腺細(xì)胞的增殖情況[11]。譚文波等[12]報道川續(xù)斷含有的維生素E可以通過提高SOD和GSH-Px的活性，降低MAD的生成，延緩免疫器官的萎縮。本試驗發(fā)現(xiàn)，灌胃川續(xù)斷水煎液后可顯著提高試驗小鼠胸腺指數(shù)（<0.05），皮質(zhì)部與髓質(zhì)部分界線清晰，皮質(zhì)中胸腺細(xì)胞大量密集，減緩了胸腺組織的生理性萎縮進(jìn)程，這與鄭素玲等[13]報道的結(jié)果相一致。脾臟淋巴鞘和生發(fā)中心的多少和大小可以表明脾臟淋巴細(xì)胞的增殖情況，灌胃不同劑量川續(xù)斷水煎液后能極顯著提高試驗小鼠脾臟指數(shù)（<0.01），提高脾臟組織生發(fā)中心和淋巴鞘的淋巴細(xì)胞密集程度，促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞的增殖。這與中藥增強動物機體免疫功能的相關(guān)研究報道結(jié)果相一致[14-16]。

巨噬細(xì)胞作為天然免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞具有極強的吞噬能力，該功能的激活包括細(xì)胞增殖及功能活躍兩個方面，常用廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α）相結(jié)合反映巨噬細(xì)胞的增殖狀態(tài)及功能狀態(tài)。大量研究證實中藥及其提取物可顯著增強吞噬細(xì)胞的吞噬功能，提高吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬活性[17-19]。本試驗中，灌胃不同劑量的川續(xù)斷水煎劑后均顯著或極顯著提高了試驗小鼠吞噬細(xì)胞的碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，說明川續(xù)斷水煎劑可提高機體巨噬細(xì)胞的吞噬功能，從而增強機體的非特異性免疫功能。

體液免疫是由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。許多中草藥及其活性成分均能促進(jìn)機體的體液免疫功能，促進(jìn)抗體的生成，從而提高機體的免疫力[20-22]。血清溶血素是機體B淋巴細(xì)胞在受到抗原刺激后分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，其含量反映了抗原刺激后機體的特異性免疫反應(yīng)水平。本研究結(jié)果顯示，灌服川續(xù)斷水煎液后試驗小鼠血清溶血素含量呈現(xiàn)升高趨勢，表明川續(xù)斷水煎液可提高機體的體液免疫功能，這與相關(guān)中藥研究報道結(jié)果一致[7]。

綜上表明，川續(xù)斷水煎液可有效增強小鼠非特異性免疫功能，尤以20 g·kg-1灌胃劑量效果最佳，為進(jìn)一步研究川續(xù)斷作為免疫增強劑或飼料添加劑提供了的理論依據(jù)。

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Effect ofdecoction on nonspecific immune function in mice

ZHOU Bingxin1, ZHANG Lei1,2, LI Yantao1, MA Yue1,3,4, CAO Liting1,3,4

(1. College of Veterinary Medicine, Southwest University, Chongqing 402460; 2. Qixing District Agriculture and Animal Husbandry Bureau in Bijie City, Bijie 551700; 3. Research Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine, Southwest University, Chongqing 402460; 4. Chongqing Engineering Research Center of Veterinary Medicine, Chongqing 402460)

In order to estimate the regulatory effects on immune function, this study was conducted to investigate the effect ofdecoction on nonspecific immune function in mice in order to estimate the regulatory effects on immune function. Forty healthy Kunming mice were randomly divided into 5 groups with 8 mice each. All the experimental mice were intragastrically administrated different doses ofdecoction respectively (10, 20, 30 and 40 g·kg-1body weight) with the final concentration of 2 g·mL-1for 7 d, and physiological saline was administrated for the control group. The average daily gain (ADG), pathological changes of thymus and spleen, phagocytic activity of macrophages and serum hemolysin were detected before and after administration to evaluate the nonspecific immune function of the experimental animals. The results indicated that the average daily gain was increased at different extent after oral administration ofdecoction compared with control group, and the ADG rates were 9.8%, 29.2%, 24.4% and 24.3% in each group, respectively. And it could significantly increase the spleen and thymus index of mice (<0.05), and significantly promote the immune tissue of mice. The lymphocytes in the lymphatic sheath around the central artery of the spleen were concentrated, the boundary between the thymus cortex and medulla was clear, and the thymic cells were increased. It can also significantly enhance the clearance index (<0.01), phagocytosis index and serum hemolysin level (<0.05). It suggested thatdecoction enhance the non-specific immune function of mice.

decoction; mice; immune organ index; clearance index; phagocytic index; serum hemolysin; non-specific immunity

S 853.7

A

1672-352X (2021)05-0796-05

10.13610/j.cnki.1672-352x.20211105.003

2021-11-11 16:29:14

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20211110.1506.002.html

2021-01-27

西南大學(xué)博士基金（09BSR04）和西南大學(xué)榮昌校區(qū)青年基金共同資助。

周炳鑫，碩士研究生。E-mail：1059475677@qq.com

通信作者:曹立亭，博士，副教授。E-mail：caoliting@swu.edu.cn