李東梅， 楊雅雯， 黨喜同， 左東川

（西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州646000）

低鉀血癥（血清鉀濃度低于3.5 mmol/L）是常見的電解質(zhì)紊亂之一，可導(dǎo)致心律失常，危及生命［1-3］。心肌細(xì)胞靜息狀態(tài)下的膜電位呈現(xiàn)超極化，是維持心肌細(xì)胞正常興奮性和傳導(dǎo)性的必要條件。心肌細(xì)胞在靜息狀態(tài)下主要開放背景鉀離子通道，因此心肌細(xì)胞的靜息膜電位接近鉀離子平衡電位（約-80 mV）。根據(jù)Nernst 方程，當(dāng)細(xì)胞外鉀離子濃度（extracellular K+concentration，［K+］e）降低時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流增強(qiáng)，心肌細(xì)胞靜息膜電位應(yīng)處于超極化狀態(tài)，例如小鼠和大鼠的心肌細(xì)胞［4-5］。但以往在成人心肌細(xì)胞及羊和狗浦肯野纖維的研究表明，當(dāng)［K+］e降低時(shí)，心肌細(xì)胞靜息膜電位呈現(xiàn)異常去極化（約為-40 mV）［6-10］。盡管這一異常的電生理現(xiàn)象與低鉀血癥誘發(fā)的心律失常密切相關(guān)，但其具體分子機(jī)制仍不明確。

雙孔鉀通道是近年發(fā)現(xiàn)的一類新型鉀離子通道超家族，包含15 個(gè)亞型。雙孔鉀通道屬于背景鉀離子通道，參與細(xì)胞靜息膜電位的維持［11-14］。TWIK-1雙孔鉀通道屬于雙孔鉀通道家族，是從人類腎組織中克隆出的第一個(gè)雙孔鉀通道亞型［15］。盡管TWIK-1通道在心肌細(xì)胞高度表達(dá)，但其調(diào)控心肌細(xì)胞電生理特性的病理生理意義尚不明確。雙孔鉀通道在結(jié)構(gòu)上與其它類型鉀通道不同，屬于二聚體而不是四聚體，其功能性亞基含有4個(gè)跨膜片段、2個(gè)孔區(qū)（P1和P2）及位于孔區(qū)的選擇性過濾器。TWIK-1通道的離子選擇過濾器是位于P1孔區(qū)的一段高度保守的非對(duì)稱性氨基酸序列（TxGYG）［16］。我們的前期研究表明，在低［K+］e條件下，TWIK-1通道的離子選擇性發(fā)生改變而介導(dǎo)內(nèi)向鈉離子電流，而位于通道P1 孔區(qū)選擇性過濾器的第118 位蘇氨酸（T118）在這一過程中起到關(guān)鍵作用［17］。這說明，在低［K+］e條件下，TWIK-1通道的功能不再是維持細(xì)胞靜息膜電位超極化，而是使靜息膜電位去極化。我們推測(cè)，TWIK-1 通道功能的異常可能在低鉀誘發(fā)心肌細(xì)胞靜息膜電位異常去極化的過程中起到了重要作用。本實(shí)驗(yàn)以小鼠HL-1細(xì)胞為心肌細(xì)胞模型，探討在低［K+］e條件下TWIK-1通道功能的改變對(duì)心肌細(xì)胞靜息膜電位的影響及其機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素和胰酶細(xì)胞消化液（Gibco）；胎牛血清（HyClone）；河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX）和CoCl2（Sigma）。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 攜帶人TWIK-1和TWIK-1-T118i突變體基因序列的慢病毒載體（滴度1×1011TU/L）由賽業(yè)生物科技包裝。載有各基因序列及綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒預(yù)先用DMEM 培養(yǎng)液以1∶1 000的比例稀釋，分裝于EP管中，保存于-80 ℃冰箱中備用。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞與HL-1 小鼠心肌細(xì)胞均來自西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所（醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。2 種細(xì)胞均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。細(xì)胞接種于含有玻片的培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞加入預(yù)先稀釋好的病毒，放入孵育箱共同培養(yǎng)48 h 后，用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。所轉(zhuǎn)染病毒均攜帶GFP，用于檢測(cè)細(xì)胞是否轉(zhuǎn)染成功。

2.2 電生理 采用HEKA膜片鉗系統(tǒng)（EPC10）在電流鉗模式下記錄細(xì)胞靜息膜電位；在電壓鉗模式下記錄全細(xì)胞電流，斜坡刺激方案為電壓從-140 mV去極化到100 mV，跨度為2 200 ms［17-18］。采用電阻為2～3 歐姆的玻璃電極，形成封接，破膜后進(jìn)行記錄。記錄CHO 細(xì)胞的電極內(nèi)液組成為（mmol/L）：140 KCl，1 MgCl2，10 EGTA，1 K2-ATP，5 HEPES（pH 7.4）。電極外液組成為（mmol/L）：135 NaCl，5 KCl，2 CaCl2，1 MgCl2，15 glucose，10 HEPES（pH 7.4）。記錄HL-1 心肌細(xì)胞的電極內(nèi)液組成為（mmol/L）：20 KCl，120 potassium aspartate，1 MgCl2，5 Na2-ATP，0.5 Na2-GTP，10 EGTA，5 HEPES（pH 7.4）。電極外液組成為（mmol/L）：140 NaCl，5.4KCl，1.8 CaCl2，1 MgCl2，10 glucose，10 HEPES（pH 7.4）。

為了檢測(cè)低［K+］e對(duì)細(xì)胞膜電位及全細(xì)胞電流的影響，細(xì)胞外液中鉀離子濃度降低至2.7 mmol/L，同時(shí)，相應(yīng)提高外液中NaCl 的濃度，以維持外液總滲透壓不變。為了記錄低［K+］e條件下TWIK-1 通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉電流，低鉀外液中加入2 mmol/L CoCl2及500 μmol/L TTX 以阻斷心肌細(xì)胞電壓門控鈣通道及鈉通道電流［18］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所記錄電生理數(shù)據(jù)采用IGOR Pro軟件進(jìn)行制圖和統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

結(jié) 果

1 低［K+］e時(shí)，表達(dá)人 TWIK-1 通道的 CHO 細(xì)胞靜息膜電位發(fā)生去極化

CHO 細(xì)胞經(jīng)載有TWIK-1基因序列的慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，膜片鉗可記錄到典型的TWIK-1通道全細(xì)胞電流（圖1A）。當(dāng)［K+］e為5.4 mmol/L 時(shí)，CHO 細(xì)胞的靜息膜電位為（-77.0±0.9）mV，當(dāng)［K+］e降為2.7 mmol/L 時(shí)，CHO 細(xì)胞的靜息膜電位首先呈現(xiàn)超極化，隨著細(xì)胞外低鉀溶液灌流時(shí)間的延長(zhǎng)，靜息膜電位緩慢去極化到（-58.0±1.2）mV，當(dāng)［K+］e恢復(fù)到5.4 mmol/L 時(shí)，靜息膜電位恢復(fù)到靜息水平（圖1B）。此外，當(dāng)［K+］e從 5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時(shí)，TWIK-1 通道全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位由（-77.0±0.9）mV去極化到（-59.0±1.3）mV（圖1C）。

2 低［K+］e時(shí)，TWIK-1通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉離子電流引起CHO細(xì)胞靜息膜電位去極化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TWIK-1通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉離子電流是低［K+］e引起CHO細(xì)胞靜息膜電位去極化的關(guān)鍵，我們將細(xì)胞外低鉀溶液的鈉離子替換為N-甲基-D-葡萄糖胺（N-methyl-D-glucamine，NMDG）。膜片鉗結(jié)果顯示，當(dāng)［K+］e從5.4 mmol/L 降為2.7 mmol/L 時(shí)，表達(dá)人TWIK-1 通道的CHO 細(xì)胞的靜息膜電位維持在（-93.0±2.5）mV，去極化現(xiàn)象消失（圖2A），且全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位維持在（-90.0±3.5）mV（圖2B）。在表達(dá)人TWIK-1-T118i 突變體通道的CHO 細(xì)胞，當(dāng)［K+］e從 5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時(shí)，靜息膜電位維持在（-94.0±3.5）mV，去極化現(xiàn)象消失（圖2C）。

3 低［K+］e時(shí)，表達(dá)人TWIK-1 通道的HL-1 小鼠心肌細(xì)胞靜息膜電位發(fā)生去極化

我們采用HL-1 小鼠心肌細(xì)胞系作為心肌細(xì)胞模型，觀察2.7 mmol/L［K+］e對(duì)其膜電位及全細(xì)胞電流的影響。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對(duì)照組HL-1 細(xì)胞，當(dāng)［K+］e從5.4 mmol/L降為2.7 mmol/L時(shí)，靜息膜電位發(fā)生超極化，維持在（-88.0±2.0）mV（圖3A），并且全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位維持在（-83.0±3.5）mV（圖3B）。而在表達(dá)TWIK-1 通道的HL-1 細(xì)胞，當(dāng)［K+］e從 5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時(shí)，靜息膜電位首先呈現(xiàn)超極化，隨著細(xì)胞外低鉀溶液灌流時(shí)間的延長(zhǎng)，靜息膜電位發(fā)生緩慢去極化，維持在（-43.0±3.0）mV，且全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位維持在（-41.0±2.5）mV（圖3C、D）。此外，用表達(dá)人TWIK-1-T118i突變體通道的HL-1 細(xì)胞作為陰性對(duì)照，當(dāng)［K+］e從5.4 mmol/L 降為 2.7 mmol/L 時(shí)，HL-1 細(xì)胞靜息膜電位維持在（-88.0±3.0）mV，去極化現(xiàn)象消失，且全細(xì)胞電流的反轉(zhuǎn)電位維持在（-84.0±3.5）mV（圖4）。

Figure 2. The inward Na+currents conducted by TWIK1 channel contributed to membrane potential depolarization of the CHO cells at 2.7 mmol/L［K+］e（2.7K）. A：representative resting membrane potential of the CHO cells expressing human TWIK-1 channel was shown when N-methyl-D-glucamine（NMDG）-based bath solution was reversibly changed from 5.4 mmol/L［K+］e（5.4K）to 2.7K；B：representative whole-cell ramp currents in the CHO cells engineered to express human TWIK-1 channel before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K（black line）to 2.7K（red line）or changed to NMDG-based bath solution containing 2.7K（blue line）；C：representative resting membrane potential of the CHO cells expressing human TWIK-1-T118i channel was shown when NMDG-based bath solution was reversibly changed from 5.4K to 2.7K. Mean±SD. n=7.圖2 細(xì)胞外低鉀條件下，TWIK-1通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉離子電流引起CHO細(xì)胞靜息膜電位去極化

討 論

TWIK-1 雙孔鉀通道在心肌細(xì)胞高度表達(dá)，但其調(diào)控心肌細(xì)胞電生理特性的病理生理意義尚不明確。Christensen 等［19］將斑馬魚心臟的TWIK-1基因敲除，發(fā)現(xiàn)心跳速率明顯變緩，說明TWIK-1 通道參與了心肌細(xì)胞自律性的調(diào)控。我們的前期研究結(jié)果表明，在細(xì)胞外低鉀條件下，TWIK-1 通道離子選擇性發(fā)生改變并介導(dǎo)內(nèi)向鈉離子電流［17-18］。心肌細(xì)胞靜息膜電位的維持依靠背景鉀離子通道，TWIK-1 通道屬于背景鉀離子通道。我們推測(cè)，在低［K+］e條件下，TWIK-1 通道功能的改變可能會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞靜息膜電位產(chǎn)生影響。因此，我們首先在異源表達(dá)系統(tǒng)CHO細(xì)胞，觀察了TWIK-1通道功能的改變對(duì)靜息膜電位的影響。本研究結(jié)果表明，在低［K+］e條件下，轉(zhuǎn)染TWIK-1 通道的CHO 細(xì)胞的靜息膜電位呈現(xiàn)去極化。這一結(jié)果說明，在低［K+］e條件下TWIK-1通道功能的改變能夠引起靜息膜電位去極化。以往研究表明，小鼠心肌細(xì)胞的靜息膜電位在低［K+］e條件下呈現(xiàn)超極化而不是去極化，并且小鼠心肌細(xì)胞不表達(dá)TWIK-1 通道［20-22］。因此，我們采用 HL-1 小鼠心肌細(xì)胞作為心肌細(xì)胞模型，觀察TWIK-1通道功能的改變對(duì)心肌細(xì)胞靜息膜電位的影響。本研究結(jié)果表明，在低［K+］e條件下，轉(zhuǎn)染 TWIK-1 通道的 HL-1 小鼠心肌細(xì)胞靜息膜電位發(fā)生去極化（約-40 mV）。這一結(jié)果與以往在成人心肌細(xì)胞觀察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［4-6］。上述研究結(jié)果表明，在低［K+］e條件下，TWIK-1 通道功能的改變能夠引起心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化。

心肌細(xì)胞靜息膜電位異常去極化是低鉀血癥誘發(fā)心律失常的主要病理基礎(chǔ)之一，但其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。靜息膜電位是由細(xì)胞膜離子通道介導(dǎo)的內(nèi)向電流和外向電流的動(dòng)態(tài)平衡決定的。細(xì)胞膜離子通道介導(dǎo)的外向電流減弱或內(nèi)向電流增強(qiáng)均會(huì)引起靜息膜電位發(fā)生去極化［23］。Sheu等［24］和Gadsby等［25］在羊和成人心肌細(xì)胞的研究表明，去除細(xì)胞外液的鈉離子后，低鉀誘發(fā)的心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化現(xiàn)象消失。上述研究說明鈉離子內(nèi)流是低鉀導(dǎo)致心肌細(xì)胞靜息膜電位異常去極化的關(guān)鍵因素。為了證明TWIK-1 通道介導(dǎo)的鈉離子內(nèi)流能夠引起心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化，我們首先在轉(zhuǎn)染TWIK-1通道的CHO 細(xì)胞證明了TWIK-1 通道介導(dǎo)的鈉離子內(nèi)流引起CHO 細(xì)胞靜息膜電位去極化，因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞外液的鈉離子替換為NMDG 時(shí)，低鉀誘發(fā)的靜息膜電位去極化現(xiàn)象消失。其次，我們?cè)贖L-1 小鼠心肌細(xì)胞證明了TWIK-1 通道介導(dǎo)的鈉離子內(nèi)流能夠引起心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化，因?yàn)檗D(zhuǎn)染TWIK-1-T118i 突變體通道的HL-1 小鼠心肌細(xì)胞的靜息膜電位呈現(xiàn)超級(jí)化，而TWIK-1-T118i 突變體通道在低［K+］e條件下不介導(dǎo)內(nèi)向鈉離子電流［19-20］。

Figure 3. Membrane potential depolarization occurred in mouse HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of TWIK1 channel at 2.7 mmol/L［K+］e（2.7K）. A：representative resting membrane potential of HL-1 cardiomyocytes was shown when Na+-based bath solution was reversibly changed from 5.4 mmol/L［K+］e（5.4K）to 2.7K；B：representative whole-cell ramp currents in HL-1 cardiomyocytes before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K（black line）to 2.7K（red line）；C：representative resting membrane potential of HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1 channel was shown when Na+-based bath solution was reversibly changed from 5.4K to 2.7K；D：representative wholecell ramp currents in HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1 channel before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K（black line）to 2.7K（red line）. Mean±SD. n=5.圖3 表達(dá)人TWIK1通道的HL1小鼠心肌細(xì)胞在細(xì)胞外低鉀條件下膜電位發(fā)生去極化

Figure 4. Mouse HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of TWIK1-T118i channel showed hyperpolarized membrane potential at 2.7 mmol/L［K+］e（2.7K）. A：representative resting membrane potential of HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1-T118i channel was shown when Na+-based bath solution was reversibly changed from 5.4 mmol/L［K+］e（5.4K）to 2.7K；B：representative whole-cell ramp currents in HL-1 cardiomyocytes with ectopic expression of human TWIK-1-T118i channel before and after Na+-based bath solution was changed from 5.4K（black line）to 2.7K（red line）. Reversal potential of TWIK-1 channel currents at 2.7K was（-84.0±1.5）mV. Mean±SD. n=5.圖4 表達(dá)人TWIK1-T118i通道的HL1小鼠心肌細(xì)胞在細(xì)胞外低鉀條件下膜電位發(fā)生超極化

綜上所述，本研究證明了在低［K+］e條件下TWIK-1 通道介導(dǎo)的內(nèi)向鈉離子電流能夠引起小鼠心肌細(xì)胞靜息膜電位去極化。鑒于TWIK-1 通道在人心肌細(xì)胞高度表達(dá)而在小鼠心肌細(xì)胞不表達(dá)，因此，在低［K+］e條件下，TWIK-1 通道功能的改變是否能夠引起人心肌細(xì)胞靜息膜電位異常去極化仍需通過基因敲除等方法在人心肌細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證。