焦煥然，周冰謙，楊國紅，盧恒，王曉，郭蘭萍，劉偉

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）/山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700）

近十幾年來，隨著藥用植物固定產(chǎn)地和長期單品種機械化連續(xù)種植，95%以上的常見栽培品種發(fā)生連作障礙，出現(xiàn)發(fā)育不良、病害加重的現(xiàn)象，如人參、太子參、三七、地黃、丹參等［1］。由此而引起的中藥材產(chǎn)量、品質(zhì)下降問題日趨嚴(yán)重，并制約了中藥資源的可持續(xù)發(fā)展。

連作障礙的形成是植物、土壤、微生物等各種因素綜合作用的結(jié)果，其中化感物質(zhì)和土壤微生物群落及其與植物之間的反饋調(diào)節(jié)作用是近年來的研究熱點。化感作用是植物在長期進(jìn)化過程中形成的適應(yīng)環(huán)境、提高生存競爭力的獨特策略［2］，植物通過根系分泌物的方式產(chǎn)生化感物質(zhì)［3］，在連作條件下，這些化感物質(zhì)在土壤中逐漸積累，除直接抑制種子萌發(fā)和植物生長代謝、增加植株感病率外，還可為根際有害微生物生長提供重要的碳源和能量［4－6］，通過選擇性促進(jìn)病原微生物的增殖而間接致害植物。因此，化感物質(zhì)和病原微生物之間可能存在著一定的協(xié)同致害作用。本文根據(jù)近年來的研究進(jìn)展，分析總結(jié)酚酸類物質(zhì)介導(dǎo)病原真菌產(chǎn)生協(xié)同致害作用的機理，旨在為進(jìn)一步深入研究連作障礙形成機理及消減策略、促進(jìn)中藥材產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 酚酸類化感物質(zhì)及其對植物的影響

化感物質(zhì)來源于植物分泌物和腐解物，常見的化感物質(zhì)有酚酸類、萜類、甾體類、生物堿類和產(chǎn)氰苷類等［7］。其中酚酸類物質(zhì)已被證明是單一連作體系中活性較強的化感物質(zhì)［8］，主要分為羥基肉桂酸、羥基苯甲酸以及類黃酮類。研究表明，連作障礙與土壤中酚酸類化感物質(zhì)的積累密切相關(guān)［9］。其致害作用表現(xiàn)為抑制種子萌發(fā)和幼苗生長，破壞根系及其他分生組織［10，11］，影響光合作用、細(xì)胞膜通透性、代謝途徑和生理抗性等［12－14］。酚類的細(xì)胞毒性主要與氧化還原循環(huán)過程中產(chǎn)生的自由基有關(guān)，酚酸通過形成半醌自由基后經(jīng)過一系列反應(yīng)作用于蛋白質(zhì)、核酸和脂類等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，代謝紊亂［15］。

2 病原真菌侵染對植物的影響

真菌是連作后根腐病和枯萎病等常見病害的主要病原體，包括鐮刀菌、立枯絲核菌、腐霉菌、柱孢菌、疫霉菌等［14］。病原真菌的大量繁殖和侵染分泌的果膠酶、纖維素酶以及β－葡萄糖苷酶等細(xì)胞壁降解酶破壞了宿主植物細(xì)胞膜中間層，造成細(xì)胞內(nèi)的侵填體、果膠以及膠狀物質(zhì)阻塞導(dǎo)管，阻礙水分運輸。另一方面，病原菌生長過程中分泌的胞外毒素改變了細(xì)胞質(zhì)膜的透性，對原生質(zhì)體造成傷害，從而引起植株代謝紊亂，導(dǎo)致植物患病［16－18］。除此之外，病原菌侵染還能夠激發(fā)植物免疫系統(tǒng)，以超敏反應(yīng)（HR）使細(xì)胞程序性死亡［19］。這些生理變化，為病原菌的大量定殖創(chuàng)造了條件。

3 連作條件下酚酸介導(dǎo)病原真菌產(chǎn)生協(xié)同致害作用

研究表明，酚酸類化感物質(zhì)介導(dǎo)病原真菌產(chǎn)生致害作用加劇了連作障礙的發(fā)生。齊永志［20］發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸與尖孢鐮刀菌同時處理比兩因子單獨處理對植株生長的抑制作用更明顯，細(xì)胞膜受傷害程度加劇，并且對羥基苯甲酸使根系更易受到尖孢鐮刀菌侵染。Ye等［21］以0.25 mmol/L肉桂酸＋尖孢鐮刀菌、0.25 mmol/L肉桂酸和尖孢鐮刀菌分別處理植株幼苗，發(fā)現(xiàn)兩因素同時處理明顯降低了生物量、氣體交換參數(shù)和光合指標(biāo)，植物更快出現(xiàn)維管束褐變和萎蔫。這些結(jié)果表明連作條件下酚酸和病原真菌之間存在額外或者協(xié)同的作用。根據(jù)近年來的研究，協(xié)同效應(yīng)可以從以下幾個方面解釋。

3.1 連作條件下化感物質(zhì)驅(qū)動微生物群落重構(gòu)

植物根可向根際釋放高達(dá)20%的光合產(chǎn)物［22］，這些物質(zhì)可能成為微生物的營養(yǎng)碳源、氮源或信號刺激物［23］，通過吸引或排斥特定微生物驅(qū)動植物特有微生物群落的重構(gòu)［24］。土壤微生物群落通過參與礦物營養(yǎng)循環(huán)、有機質(zhì)周轉(zhuǎn)、土壤結(jié)構(gòu)形成和毒素去除等關(guān)鍵生化過程，影響土壤和植物［25］。Li等［26］推測，連作植物根系多年重復(fù)釋放相同類型的物質(zhì)，導(dǎo)致利用這些物質(zhì)的微生物大量定殖，從而驅(qū)動了根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化，影響連作條件下的植物生長。

連作土壤最明顯的改變是細(xì)菌的相對豐度下降，真菌的相對豐度升高，土壤從“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢婢汀保?7］。Shi等［28］通過高通量DNA測序技術(shù)分析了連作0、3、6、9年百合根際土壤樣品，結(jié)果表明長期連作顯著提高了土壤真菌群落的多樣性和豐度，高度豐富的致病真菌屬的積累和有益真菌屬的減少加劇了百合的連作障礙。長期連作破壞了枸杞根際細(xì)菌群落的功能和活性，增強了病原真菌在根際的定殖，鏈格孢屬（Alternaria）、鐮孢菌屬（Fusarium）、赤霉菌屬（Gibberella）和匍柄霉屬（Stemphylium）等病原真菌屬的群落豐度和多樣性增加［29］。連作導(dǎo)致白術(shù)根際更高的真菌多樣性，根霉菌屬（Rhizopus）、產(chǎn)紫青霉菌（Penicilliumpurpurogenum）、鏈格孢屬、Mycosphaerellapunctiformis等病原真菌明顯增加［30］。丹參連作使根際土壤真菌在界、綱及屬不同分類水平上均有較大變化，真菌的多樣性隨著連作年限的增加呈先下降后上升的趨勢，連作兩年后擬隱孢殼屬（Cryptosporiopsis）、指狀菌屬（Dactylaria）、樹粉孢屬（Oidiodendron）等致病真菌成為優(yōu)勢菌屬［31］。

研究發(fā)現(xiàn)，酚酸處理可以顯著降低太子參根際有益菌木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）的相對豐度，并增加有害菌如鐮孢菌屬、籃狀菌屬（Talaromyces）、小被孢霉屬（Mortierella）、擬青霉屬（Paecilomyces）和支頂孢屬（Acremonium）的相對豐度［32］。在非連作土壤中添加外源苯甲酸后，土壤中病原真菌相對豐度升高，如鐮孢菌屬、生赤殼屬、綠僵菌屬等［33］。在連作地黃根際檢測到5種酚酸（4－羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、3，4－二羥基苯甲酸和香草醛）濃度升高的土壤中，細(xì)菌多樣性指數(shù)、真菌多樣性指數(shù)和真菌均勻度指數(shù)均顯著升高，潛在病原菌增加［34］。以上結(jié)果說明，連作條件下以酚酸為代表的化感物質(zhì)驅(qū)動微生物群落變化，一方面，這些病原微生物可能侵染植物，另一方面，由于微生物群落的失衡使植物防御機制更易突破，增加土傳病害的發(fā)生［35］。

3.2 酚酸類化感物質(zhì)對病原真菌的誘導(dǎo)增殖

與植物個體相比，病原菌對酚酸類物質(zhì)及其濃度更敏感，當(dāng)土壤中酚酸類物質(zhì)對植物還未達(dá)到致害濃度時，微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)已經(jīng)開始發(fā)生變化［36］。Tian等［37］研究發(fā)現(xiàn)枯萎病的發(fā)生與酚酸及其濃度密切相關(guān)，酚酸誘導(dǎo)病原真菌的增殖進(jìn)而引發(fā)病害。

酚酸對病原菌的誘導(dǎo)增殖作用有兩大原因:一是可直接為病原真菌提供營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)病原菌增殖或孢子萌發(fā)，造成土傳病害的加??；二是通過降低植株保護(hù)酶活性及抗氧化系統(tǒng)抗性，增加根系的活性氧自由基含量及加重膜脂過氧化程度，造成植物本身營養(yǎng)元素的泄漏，從而對病原菌的生長產(chǎn)生刺激作用。如地黃的根系分泌物阿魏酸可以為根際尖孢鐮刀菌提供碳源［38］，使病原菌具有良好的繁殖條件，并減弱或消除某些有益菌的拮抗作用，從而使得病原菌數(shù)量不斷增加；土壤實測濃度的根皮苷、香草酸、根皮素、苯甲酸、水楊酸及5種酚酸混合物可加快病原真菌串珠鐮孢菌和尖孢鐮刀菌的菌絲分裂速度［39］；香蘭素、阿魏酸及其混合物可以顯著促進(jìn)地黃根際尖孢鐮刀菌的菌絲生長、孢子形成和毒素的產(chǎn)生［40］，這與阿魏酸、對羥基苯甲酸、丁香酸和肉桂酸處理可促進(jìn)太子參根際病原真菌生長、提高產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的結(jié)論一致［41］。病原菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長是病原菌進(jìn)行侵染和致病寄主植物的前提。

酚酸類物質(zhì)誘導(dǎo)病原真菌增殖的分子機制目前尚不明確。舒陽［38］發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠促進(jìn)尖孢鐮刀菌的生長繁殖以及產(chǎn)色素、毒素等次級代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，并鎖定與阿魏酸互作的鐮刀菌蛋白，即14－3－3蛋白和谷胱甘肽－S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S－transferase，GST）蛋白。其中14－3－3蛋白參與轉(zhuǎn)運與毒素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子到特定DNA序列，可激活相關(guān)信號通路，調(diào)控下游基因的表達(dá)；GST蛋白的主要功能是解毒，尖孢鐮刀菌可能通過GST蛋白來降低阿魏酸毒性后作為營養(yǎng)物質(zhì)加以利用。李振方［42］研究發(fā)現(xiàn)地黃分泌的化感物質(zhì)對羥基苯甲酸和阿魏酸通過增強真菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)如SH3結(jié)構(gòu)、F－box蛋白體系和分子伴侶等修飾原件，增強了對真菌營養(yǎng)代謝和基因表達(dá)過程的調(diào)控，促進(jìn)真菌對營養(yǎng)物質(zhì)的利用。另外，酚酸增加了病原真菌的H＋外排和質(zhì)膜H＋－ATPase活性，為病原菌的大量增殖提供了有利的酸性環(huán)境［33］。通過這些研究結(jié)果推測，酚酸誘導(dǎo)病原真菌增殖的作用機制可能與影響病原菌的代謝通路和基因表達(dá)有關(guān)。

酚酸類化感物質(zhì)對病原菌的促進(jìn)效應(yīng)受濃度的影響，一般表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。當(dāng)阿魏酸濃度小于100 mg/L時，對尖孢鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用隨濃度升高而增強，當(dāng)濃度大于100 mg/L時，則隨著濃度的增加抑制性急劇增加［43］；沒食子酸、對羥基苯甲酸、香蘭素酸和苯甲酸在低濃度下促進(jìn)太子參根際病原菌KosakoniasacchariW.的生長，但在高濃度下抑制其生長［44］；人參根際土壤中的沒食子酸、苯甲酸、3－苯基丙酸、肉桂酸對人參銹腐菌的生長也表現(xiàn)出低促高抑的作用［45］。具有這種濃度效應(yīng)的酚酸還有綠原酸、紫丁香酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸［46］等，不同的酚酸對病原菌從低濃度促進(jìn)到高濃度抑制的轉(zhuǎn)折點是不同的。有研究發(fā)現(xiàn)一些酚酸在低濃度時對病原真菌的菌絲生長有一定的抑制作用［47］，但是酚酸總體上對真菌還是起到促進(jìn)作用，并且大多在植物根際土壤中含量比較低。

3.3 酚酸類物質(zhì)促進(jìn)病原真菌毒素釋放

酚酸類物質(zhì)還可通過促進(jìn)病原菌分泌毒素和胞外酶等手段，改變植物組織結(jié)構(gòu)，使病菌更易侵入寄主。真菌毒素被認(rèn)為是多種植物枯萎病的致病因子，前人研究已經(jīng)證實阿魏酸以濃度依賴的方式促進(jìn)真菌毒素的產(chǎn)生［48］；丁香酸也被證明可以刺激真菌毒素在液體培養(yǎng)中的產(chǎn)生，處理組霉菌毒素的產(chǎn)量與對照組相比升高了60.9%～561.5%［49］。太子參根際病原菌TalaromyceshelicusM.經(jīng)過混合酚酸處理后，3A－DON和15ADON兩種毒素產(chǎn)量急劇增加，對植物產(chǎn)生毒害作用，并促進(jìn)其它病原真菌的生長，抑制有益細(xì)菌短小芽孢桿菌的生長，使土壤環(huán)境惡化［44］；添加外源低濃度芥子酸在刺激真菌毒素生成和積累的同時，還使果膠酶、蛋白酶、淀粉酶活性提高，破壞宿主細(xì)胞壁和防御體系［50］。以上研究結(jié)果表明，酚酸促進(jìn)了病原真菌毒素釋放，增加了病原體感染和入侵的風(fēng)險，加重了對宿主植物的損害。

3.4 病原真菌加劇化感物質(zhì)的毒性

在土壤中，化感物質(zhì)暴露于各種物理、化學(xué)和生物過程中，它們可能被解毒，也可能成為土壤生物生產(chǎn)新毒素的碳骨架［51］。研究表明，土壤病原真菌在利用酚酸的同時，酚酸也很容易通過病原菌轉(zhuǎn)化為另一種具有不同植物毒性的物質(zhì)［52］。例如阿魏酸常被微生物轉(zhuǎn)化為香草酸［53］；對羥基苯甲酸的含量隨著對香豆酸的迅速減少而增加［54］；病原菌KosakoniasacchariW.能夠利用香蘭素產(chǎn)生一種中間產(chǎn)物原兒茶酸，而原兒茶酸對土壤中有益的短小雙歧桿菌的生長有負(fù)面影響［55］。研究表明地黃產(chǎn)生的4種酚酸的混合物對幼苗的抑制作用比每種單一酚酸更強［35］，不同酚酸之間也存在著協(xié)同作用［56，57］。

Gu等［58］將健康和病原菌感染的植株分泌物添加到未施肥的土壤中，發(fā)現(xiàn)病原菌的存在改變了酚類化合物的分泌，增加了咖啡酸的釋放，并且受感染植物的分泌物導(dǎo)致土壤微生物多樣性降低。同樣，有研究報道在尖孢鐮刀菌侵染太子參后，參與苯丙酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因如PAL和CCoAOMT基因表達(dá)上調(diào)，有利于酚酸類化合物的合成，C4H、C4L和CAD基因表達(dá)下調(diào)，抑制了酚酸類化合物的降解［19］。這一結(jié)果表明，一些酚酸化合物可能是在植物感染病原菌后積累起來的［59］，病原真菌的感染可能增加了酚酸類物質(zhì)的合成途徑。并且，由于微生物群落的改變，能夠降解有毒化合物的細(xì)菌數(shù)量的減少也導(dǎo)致了有毒化合物在土壤中的積累［60］。因此，通過病原真菌對酚酸的轉(zhuǎn)化和積累，土壤中酚酸的含量逐漸升高，毒性增強，多樣性增加。

4 問題與展望

雖然化感物質(zhì)對植物的致害作用不容忽視，但是考慮到酚酸很容易被微生物降解，連作障礙的主要元兇可能不是在土壤中檢測到的殘留酚酸，微生物利用酚酸產(chǎn)生的一系列反應(yīng)才是化感作用的核心。本文重點總結(jié)了酚酸類物質(zhì)介導(dǎo)病原真菌產(chǎn)生協(xié)同致害可能的原因，即化感物質(zhì)選擇性驅(qū)動微生物群落改變，誘導(dǎo)病原真菌增殖和毒素釋放，在對植物造成生物脅迫的同時加劇了化感物質(zhì)的毒性，進(jìn)一步對植物造成損傷。

目前化感物質(zhì)介導(dǎo)病原真菌產(chǎn)生協(xié)同致害作用的研究還停留在實驗室階段，大多數(shù)只能通過體外培養(yǎng)來證明其相互作用，在真實的田間環(huán)境中，植物、土壤、微生物各種因素更加復(fù)雜，根際生態(tài)系統(tǒng)中特定微生物的功能有待驗證，如何更加直接地表征微生物對化感物質(zhì)的利用及代謝是未來需要進(jìn)一步深入研究的問題。另外，關(guān)于協(xié)同作用的分子機制研究不夠深入且系統(tǒng)，基因測序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)是當(dāng)前研究的主要手段，分子研究能夠較好地明晰植物與根際微生物所需的植物轉(zhuǎn)運蛋白，然而目前仍然有大多數(shù)信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路未被探索，對于其中涉及的細(xì)胞、生化和轉(zhuǎn)錄變化目前知之甚少。

中藥材是中醫(yī)藥事業(yè)傳承和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，連作障礙導(dǎo)致的產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣、病蟲害加重等問題日益突出，連作障礙的發(fā)生是植物、微生物和土壤之間復(fù)雜的、循環(huán)的相互作用結(jié)果，而不僅僅是單一因素的作用。運用分析化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等方法闡明這些生物學(xué)過程，將對消減和克服連作障礙、保證臨床用藥的安全性、有效性和穩(wěn)定性具有重要意義。