內(nèi)分泌干擾物對(duì)核受體二聚化影響的研究進(jìn)展

黃付晏，陳欽暢，譚皓月，郭婧，于南洋，史薇，于紅霞

污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023

核受體(nuclear receptor, NR)超家族是由天然激素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TFs)，在細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖以及代謝中發(fā)揮著重要作用[1]。環(huán)境中存在大量小分子有機(jī)化合物，如雙酚A(bisphenol A, BPA)、羥基化多溴聯(lián)苯醚(hydroxylated polybrominated diphenyl ethers, OH-PBDEs)、多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)、多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)和殺蟲劑等，它們會(huì)通過模仿或拮抗天然激素，靶向NR，進(jìn)而產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，導(dǎo)致不良健康影響[2-4]，這種化合物被稱為內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)。EDCs會(huì)導(dǎo)致人類產(chǎn)生嚴(yán)重的生殖發(fā)育疾病，如癌癥[5]、心血管疾病[6]、肥胖[7]及生殖異常[8]等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，歐盟EDCs相關(guān)疾病的治療費(fèi)用達(dá)到歐盟內(nèi)部生產(chǎn)總值的1.28%[9]，美國(guó)達(dá)到2.33%[10]。

有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)的概念被用來(lái)描述內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。當(dāng)EDCs作用于核受體后，會(huì)誘導(dǎo)分子啟動(dòng)事件(molecular initiating events, MIEs)的發(fā)生，即EDCs首先與核受體的配體結(jié)合口袋(ligand binding pocket, LBP)相結(jié)合，模擬或拮抗內(nèi)源性激素配體與核受體結(jié)合形成核受體-化合物復(fù)合物，進(jìn)而該復(fù)合物轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)形成同源二聚體(homodimer)或異源二聚體(heterodimer)，結(jié)合到DNA反應(yīng)原件(DNA-responsive element, DRE)上，通過招募共激活因子(coactivator, COA)或共抑制因子(corepressor, COR)啟動(dòng)或抑制轉(zhuǎn)錄[11-12]。MIEs反映EDCs與靶標(biāo)核受體間的相互作用，其進(jìn)一步引起細(xì)胞層次、器官層次等一系列關(guān)鍵事件(key events, KEs)的變化，最終導(dǎo)致內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。目前對(duì)于EDCs分子啟動(dòng)機(jī)制的研究主要針對(duì)EDCs與核受體的結(jié)合過程，忽視了其對(duì)核受體二聚化過程的影響，而該過程的阻斷可直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活[13]。因此，本文從EDCs介導(dǎo)的核受體二聚化轉(zhuǎn)錄機(jī)制、核受體二聚化與轉(zhuǎn)錄活性間的關(guān)系以及基于活細(xì)胞的核受體二聚化研究方法3個(gè)方面對(duì)EDCs對(duì)核受體二聚化的影響進(jìn)行了概述。

1 核受體轉(zhuǎn)錄機(jī)制(Transcription mechanism of nuclear receptor)

1.1 人類核受體家族

人類存在48個(gè)核受體(表1)，基于其配體以及二聚化特征可將它們分為3類：(1)I類，也被稱為類固醇核受體(steroid nuclear receptor)，包括雌激素受體(estrogen receptor, ER)、雄激素受體(androgen receptor, AR)等。類固醇核受體主要以同源二聚體結(jié)構(gòu)調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄過程[14-15]。其中，ER存在2種亞型，ERα和ERβ，可分別形成ERα同源二聚體、ERβ同源二聚體和ERα-ERβ異源二聚體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[16]。(2)II類，也被稱為非類固醇核受體(non-steroid nuclear receptors)，包括甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptorα/β, TRα/β)、維甲酸受體(retinoic acid receptorα/β/γ, RARα/β/γ)以及組成型雄烷受體(constitutive androstane receptor, CAR)、類法尼醇X受體(farnesoid X receptorα/β, FXRα/β)等。該類核受體主要與維甲酸X受體(retinoid X receptorα/β/γ, RXRα/β/γ)形成異源二聚體調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如RAR-RXR[17]、FXR-RXR[18]和CAR-RXR[19]等。(3)Ⅲ類，也被稱為孤兒核受體，其內(nèi)源性配體還未發(fā)現(xiàn)或一部分核受體不存在配體，包括小異二聚體伴侶(short heterodimeric partner, SHP)、睪丸受體(testicular orphan receptor 2/4, TR2/4)等。這類核受體多數(shù)可以以單體或同源二聚體的形式結(jié)合各自的DRE來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的表達(dá)。特別地，NR相關(guān)因子(nur-related factor 1, NURR1)可與RXR形成異源二聚體，并能被RXR配體結(jié)合激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程[20-24]。

1.2 核受體二聚體

已發(fā)表的大量結(jié)構(gòu)化和功能化數(shù)據(jù)證實(shí)，核受體的DNA結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)和配體結(jié)合域(ligand binding domain, LBD)與二聚過程高度相關(guān)[25]。由于DBD貢獻(xiàn)的二聚化界面很小[26]，而LBD貢獻(xiàn)很大的二聚化界面，能夠提供更大的二聚體穩(wěn)定性，因此人們普遍認(rèn)為L(zhǎng)BD對(duì)二聚過程存在決定性的作用[27]。

1.2.1 典型核受體二聚體

核受體主要以同源二聚體或異源二聚體的形式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。表1中3種類型的同源二聚體或與RXR形成的異源二聚體形式被認(rèn)為是典型二聚體(typical dimers)[28]。部分典型異源二聚體存在的一個(gè)固有特征是既可被自身配體直接激活，又可被RXR的配體介導(dǎo)激活。因此，基于此特性可將典型異源二聚體進(jìn)一步分為2類，第1類可被自身配體或者RXR配體激活，第2類只能被自身配體激活而RXR沉默[29-30]。特別地，對(duì)于第1類異源二聚體而言，如PPAR、CAR和LXR，當(dāng)核受體自身的內(nèi)源配體和伴侶RXR的配體同時(shí)存在時(shí)能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[31]。

通過結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，大部分典型核受體二聚體已有基于LBD的二聚體結(jié)晶結(jié)構(gòu)(https://www.rcsb.org/)。通過對(duì)不同核受體二聚化結(jié)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，我們發(fā)現(xiàn)不同核受體產(chǎn)生的二聚體構(gòu)象之間存在顯著差異(圖1)。

1.2.2 典型核受體二聚體的構(gòu)象差異

多數(shù)典型核受體二聚體會(huì)由每個(gè)單體(monomer)的第9號(hào)α螺旋鏈(Helix 9)、第10號(hào)α螺旋鏈(Helix 10)和11號(hào)α螺旋鏈(Helix 11)互相接觸構(gòu)成二聚化界面(圖1(a)、(b)和(c))，這種被稱為經(jīng)典二聚體結(jié)構(gòu)[32-34]。有趣的是，一些核受體如AR、糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)、鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor, MR)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)等的二聚化方式與這種經(jīng)典的二聚體完全相反(圖1(d)和(e))[35-37]，呈現(xiàn)出2個(gè)單體的5號(hào)α螺旋鏈(Helix 5)頭對(duì)頭的松散型二聚體構(gòu)型。根據(jù)歐洲蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL-EBI)的PDBePISA模塊(https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/)提供的核受體界面信息發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典結(jié)構(gòu)的二聚化界面能貢獻(xiàn)更大的界面面積以及更多的相互作用。如ERα-ERα同源二聚體擁有高達(dá)14.561 nm2的二聚化界面面積，RAR-RXR和CAR-RXR異源二聚體界面面積分別達(dá)到11.963 nm2和12.112 nm2，而AR-AR、GR-GR同源二聚體界面面積分別只有10.003 nm2和8.095 nm2。氫鍵(hydrogen bonds)和疏水相互作用(hydrophobic interactions)是形成二聚界面的2種主要作用力。對(duì)氫鍵進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典二聚體構(gòu)型，如ERα-ERα同源二聚體、RAR-RXR和CAR-RXR異源二聚體界面氫鍵數(shù)分別達(dá)到10、19和12個(gè)，而松散型二聚體AR-AR、GR-GR同源二聚體界面氫鍵只有5個(gè)，氫鍵數(shù)目越多表明界面相互作用越強(qiáng)。而界面溶劑化自由能(solvation free energy,ΔG)越負(fù)，表明核受體二聚體界面的疏水接觸越多，通過對(duì)多種二聚體的ΔG分析發(fā)現(xiàn)，不同核受體產(chǎn)生的同種類型的二聚化構(gòu)型之間也存在明顯的差異性。例如，對(duì)于結(jié)構(gòu)緊密的經(jīng)典型二聚體，ER-ER同源二聚體界面ΔG為-59.9 kJ·mol-1，具有很強(qiáng)的疏水相互作用，而CAR-RXR異源二聚體界面ΔG只有-14.2 kJ·mol-1。而對(duì)于結(jié)構(gòu)松散型二聚體，GR-GR同源二聚體界面ΔG達(dá)到-46.9 kJ·mol-1，AR-AR同源二聚體界面只有-12.1 kJ·mol-1(圖1和表2)。

1.2.3 非典型異源二聚體

除了與RXR伴侶生成典型核受體異源二聚體以外，有大量研究表明，存在非典型異源二聚體(atypical heterodimer)，即核受體并不與RXR伴侶異源結(jié)合形成二聚，如AR-GR[38]、GR-MR[39]、GR-PPAR[40]、ER-AR[41]、ER-GR[42]和PPAR-ERR[43]等。這些非典型異源二聚體不像典型異源二聚體結(jié)構(gòu)被詳細(xì)解析，并且可能局限于特定的細(xì)胞類型和體內(nèi)生理?xiàng)l件，具有壽命短、瞬時(shí)性等特點(diǎn)，但其短暫的存在仍可能會(huì)對(duì)靶細(xì)胞或組織中基因表達(dá)產(chǎn)生強(qiáng)烈影響。因此，非典型核受體異源二聚體的生理相關(guān)性識(shí)別對(duì)配體調(diào)節(jié)核受體作用的現(xiàn)有知識(shí)提出了挑戰(zhàn)[28]。

表1 人類核受體家族Table 1 Human nuclear receptor family

1.3 核受體二聚體轉(zhuǎn)錄機(jī)制

3類核受體經(jīng)過二聚后會(huì)產(chǎn)生3類轉(zhuǎn)錄機(jī)制，具體如下：

Ⅰ類：類固醇核受體通常以單體形式或與伴侶蛋白(chaperones/cochaperones)形成復(fù)合體穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，但在配體結(jié)合后，分子伴侶解離，核受體-配體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[44](以GR為例，圖2(a))。值得注意的是，一些核受體(如AR、GR和MR)必須在配體結(jié)合后才能與分子伴侶解離以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，而一些核受體(如ER、PR)可在無(wú)配體結(jié)合情況下轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[45-46]。進(jìn)入細(xì)胞核后，這類核受體會(huì)形成同源二聚體，與其DRE結(jié)合，該反應(yīng)元件為反向完全或不完全回文結(jié)構(gòu)，后通過招募共激活因子或共抑制因子以促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄[47]。

表2 部分核受體二聚化界面參數(shù)Table 2 Interface parameters of dimerization of partial nuclear receptors

Ⅱ類：非類固醇核受體，這種核受體通常和RXR形成異源二聚體，不管是否存在激活配體，均存在于細(xì)胞核中。無(wú)配體結(jié)合時(shí)與共抑制因子形成復(fù)合物，激活配體結(jié)合后，共抑制因子解離，與共激活因子結(jié)合[48]。這種與RXR形成的異源二聚體結(jié)合的DRE為直接重復(fù)結(jié)構(gòu)[49](以RAR為例，圖2(b))。

Ⅲ類：孤兒核受體，這種核受體無(wú)激活配體時(shí)存在于細(xì)胞核中，其作用機(jī)制與第Ⅱ類核受體一致，區(qū)別就是該類核受體可自身形成同源二聚體與直接重復(fù)結(jié)構(gòu)的DRE結(jié)合[50](以VDR為例，圖2(c))。

圖2 核受體轉(zhuǎn)錄機(jī)制注：(a)GR-GR同源二聚體轉(zhuǎn)錄機(jī)制；(b)RAR-RXR異源二聚體轉(zhuǎn)錄機(jī)制；(c)VDR-VDR同源二聚體轉(zhuǎn)錄機(jī)制。Fig. 2 Transcription mechanism of nuclear receptorNote: (a) Transcription mechanism of GR-GR homodimer; (b) Transcription mechanism of RAR-RXR heterodimer; (c) Transcription mechanism of VDR-VDR homodimer.

2 內(nèi)分泌干擾物對(duì)核受體二聚的影響(Effect of endocrine disruptors on dimerization of nuclear receptors)

已經(jīng)有大量研究表明，EDCs與核受體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合過程和共因子招募過程對(duì)核受體最終的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)存在關(guān)鍵性作用[51-52]。但現(xiàn)有研究大都僅通過上述2個(gè)過程解釋內(nèi)分泌干擾活性存在假陰性或假陽(yáng)性的結(jié)果[53](https://actor.epa.gov/edsp21/)，而有研究表明在考慮核受體的二聚過程后能夠降低這種誤差[54]。因此，研究?jī)?nèi)分泌干擾物對(duì)于核受體二聚化作用的影響對(duì)于完善核受體介導(dǎo)的內(nèi)分泌干擾事件的分子機(jī)制以及準(zhǔn)確評(píng)估內(nèi)分泌干擾物的效應(yīng)具有重要意義。

2.1 內(nèi)分泌干擾物可引起核受體不同形式的二聚化

通過檢索ToxCast和Tox21數(shù)據(jù)庫(kù)中體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)針對(duì)ER做了比較完善的研究，包括化學(xué)物質(zhì)對(duì)ER競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合(NVS_NR_hER)和ER二聚化的測(cè)定，其中對(duì)ER二聚化的測(cè)定包括ERα-ERα同源二聚體(OT_ER_ERaERa_0480、OT_ER_ERaERa_1440)、ERα-ERβ異源二聚體(OT_ER_ERaERb_0480、OT_ER_ERaERb_1440)以及ERβ-ERβ同源二聚體(OT_ER_ERbERb_0480、OT_ER_ERbERb_1440)。數(shù)據(jù)庫(kù)中有多達(dá)227種EDCs物能夠影響ER二聚化(表3)。

不管在激動(dòng)劑配體還是拮抗劑配體存在的條件下，ER都可進(jìn)行二聚化[27]。然而，配體所誘導(dǎo)ER二聚化的類型是不同的，相比于ERα-ERα同源二聚體(6.09%～7.38%的活性率)，EDCs更易誘導(dǎo)ERα-ERβ異源二聚體(11.25%～12.22%的活性率)和ERβ-ERβ同源二聚體(10.02%～11.69%的活性率)(表3)。而有研究表明ERα和ERβ在調(diào)節(jié)雌激素作用中起相反作用，ERα-ERα同源二聚體促進(jìn)激素依賴的乳腺癌細(xì)胞增殖，ERβ-ERβ同源二聚體對(duì)其起抑制作用，而ERα-ERβ異源二聚體在生物體中的作用尚不清楚[55-56]。Powell和Xu[56]發(fā)現(xiàn)植物雌激素染料木黃酮(genistein)、甘草黃素(liquiritigenin)可選擇性誘導(dǎo)ERα同源二聚體、ERβ同源二聚體和ERα-ERβ異源二聚體的產(chǎn)生，Coriano等[55]研究了12種類黃酮化合物對(duì)于ER二聚體的差異性誘導(dǎo)。

一些研究也表明EDCs能夠誘導(dǎo)其他核受體不同類型的二聚體形式。Depoix等[57]研究發(fā)現(xiàn)維生素D能夠促進(jìn)VDR與RXR的異源二聚。Putcha等[58]研究發(fā)現(xiàn)了甲狀腺激素(3,5,3’-triiodothyronine, T3)和維甲酸(9-cis retinoic acid)在誘導(dǎo)TR-RXR異源二聚體間的負(fù)協(xié)同作用。Collingwood等[59]證明甲狀腺激素能夠促進(jìn)TRβ和RXR的異源二聚。研究EDCs對(duì)不同類型二聚體的誘導(dǎo)對(duì)于研究?jī)?nèi)分泌干擾物轉(zhuǎn)錄活性的生理學(xué)相關(guān)性具有重要意義。

2.2 二聚體與轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)系

分析OECD報(bào)告(Series on Testing and Assessment No. 309; http://www.oecd.org/officialdocuments)中具有體外(invitro)和體內(nèi)(invivo)雌激素活性的14種參考化學(xué)品，其體外和體內(nèi)活性數(shù)據(jù)來(lái)自美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(US Environmental Protection Agency, US EPA)開展的EDCs篩選項(xiàng)目(Endocrine Disruptor Screening Program, EDSP)中第一階段測(cè)試(Tier 1)的體外試驗(yàn)和體內(nèi)子宮營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)。將參考化學(xué)品的活性數(shù)據(jù)和Toxcast和Tox21數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于雌二醇、雌酮、己烯雌酚、5α-二氫睪酮、雙酚A、雙酚B、壬基酚、甲氧氯和滴滴涕等14種參考化學(xué)品，具有100%的二聚活性，但只有85.7%具有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性(表4)。4-壬基酚、2,4’-滴滴涕這2種物質(zhì)，其同時(shí)具有體外和體內(nèi)雌激素活性，但不具有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性，由此來(lái)看通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)活性存在假陰性，結(jié)合二聚活性能夠更好地預(yù)測(cè)ER雌激素活性。Delfosse等[60]在研究雙酚A(bisphenol A, BPA)、雙酚C(bisphenol C, BPC)和雙酚AF(bisphenol AF, BPAF)的雌激素效應(yīng)的過程中發(fā)現(xiàn)，ERα同源二聚體晶體中兩邊單體內(nèi)BPA的結(jié)合模式與天然雌激素雌二醇(estradiol, E2)類似，BPC的結(jié)合模式與抗雌激素他莫昔芬(tamoxifen, OHT)類似，有趣的是BPAF在2個(gè)單體中的結(jié)合模式相反，一個(gè)類似E2，另一個(gè)類似OHT，這種差異可能表明不同的配體對(duì)于核受體二聚化的變構(gòu)調(diào)節(jié)，從而為藥物設(shè)計(jì)提供了新的視角。同源二聚體的2個(gè)單體之間存在調(diào)節(jié)串?dāng)_，配體與一個(gè)單體的結(jié)合會(huì)調(diào)節(jié)二聚體中另一個(gè)單體的構(gòu)象[61]。Judson等[62]使用包含ER配體結(jié)合、二聚化、轉(zhuǎn)錄激活和細(xì)胞增殖測(cè)定等在內(nèi)的16個(gè)體外測(cè)試開發(fā)模型以預(yù)測(cè)1 811種化學(xué)物質(zhì)的雌激素活性，發(fā)現(xiàn)基于至少4～7個(gè)體外實(shí)驗(yàn)的亞組的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和16個(gè)測(cè)試建立的模型相當(dāng)，這些亞組模型的主要區(qū)別在于采用的二聚化測(cè)定結(jié)果不同。

表3 針對(duì)雌激素受體的Toxcast和Tox21體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合和二聚化測(cè)試結(jié)果Table 3 In vitro ligand binding and dimerization test results of ToxCast and Tox21 for estrogen receptor

表4 參考化學(xué)品的體外、體內(nèi)雌激素活性及其二聚活性Table 4 Dimerization activity of reference chemicals and its estrogen activity in vitro and in vivo

Nadal等[35]測(cè)試了配體對(duì)于誘導(dǎo)AR二聚化的影響，發(fā)現(xiàn)激動(dòng)物質(zhì)能夠誘導(dǎo)AR二聚化，拮抗物質(zhì)則不能。Depoix等[57]研究發(fā)現(xiàn)RAR激動(dòng)劑能夠顯著增加RAR-RXR的異源二聚，而RAR拮抗劑能夠抑制RAR-RXR的異源二聚。核受體二聚化與其轉(zhuǎn)錄活性的顯著相關(guān)性表明在預(yù)測(cè)EDCs誘導(dǎo)核受體轉(zhuǎn)錄活性時(shí)必須考慮其對(duì)核受體二聚化的影響。

除了配受體結(jié)合、共因子招募這2個(gè)過程，考慮核受體二聚化過程對(duì)于研究?jī)?nèi)分泌干擾效應(yīng)的產(chǎn)生至關(guān)重要。然而目前有關(guān)EDCs對(duì)核受體二聚化的影響，只對(duì)ER進(jìn)行了相對(duì)比較完善的研究，包括EDCs對(duì)于2種亞型(ERα和ERβ)各自的同源二聚體以及其一起形成的異源二聚體的影響。但EDCs對(duì)于其他核受體同源或者異源二聚體形成的影響研究相對(duì)較少，且主要集中研究各自的內(nèi)源性配體化合物或者相關(guān)藥物，今后可加強(qiáng)研究EDCs對(duì)除ER以外的其他核受體的二聚化影響。

3 核受體二聚化的研究方法(Research methods of nuclear receptor dimerization)

檢測(cè)同源或異源二聚體間蛋白-蛋白相互作用對(duì)于揭示核受體調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。目前，研究蛋白-蛋白相互作用的實(shí)驗(yàn)種類繁多，如基于蛋白結(jié)構(gòu)解析的核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)實(shí)驗(yàn)和X射線衍射(X-ray)實(shí)驗(yàn)，該類方法條件嚴(yán)格且價(jià)格昂貴[63]；基于蛋白的免疫共沉淀技術(shù)(co-immunoprecipitation, co-IP)和蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)(protein microarrays)，操作過程繁雜，無(wú)法檢測(cè)到瞬時(shí)作用，且無(wú)法在活細(xì)胞中測(cè)定[64]；另一種經(jīng)典的測(cè)試技術(shù)是酵母二雜交或三雜交(Y2H/Y3H)試驗(yàn)，由于其簡(jiǎn)單易用，該體內(nèi)技術(shù)被廣泛用于大規(guī)模檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用，然而Y2H/Y3H常因酵母細(xì)胞中異種基因的表達(dá)而產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[65]。為了克服以上缺陷，開發(fā)了一系列體內(nèi)檢測(cè)技術(shù)用于檢測(cè)活細(xì)胞中的蛋白-蛋白相互作用，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer, FRET)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)和生物分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)等，這些技術(shù)克服了非活體狀態(tài)分析蛋白間相互作用的局限性[66]，研究活細(xì)胞內(nèi)核受體二聚化的形成對(duì)包括信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在內(nèi)的多種細(xì)胞過程具有重要意義[56]。然而，由于體外細(xì)胞篩選大量的干擾物費(fèi)時(shí)費(fèi)力，計(jì)算機(jī)輔助的核受體二聚化研究應(yīng)運(yùn)而生。

3.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)

FRET技術(shù)的供體分子(donor)和受體分子(receptor)均為熒光蛋白(fluorescent protein, FP，如YFP)，其分別偶聯(lián)2個(gè)目標(biāo)蛋白，當(dāng)供體和受體分子間距離<10 nm時(shí)，處于激發(fā)態(tài)的供體熒光團(tuán)通過偶極子間的相互作用將能量以非輻射的方式轉(zhuǎn)移給鄰近的受體分子，即產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移[67](圖3(a))。

Feige等[68]利用FRET研究發(fā)現(xiàn)PPAR在沒有配體的情況下很容易與RXR形成異源二聚體。Tamrazi等[27]以位點(diǎn)特異性方式用單個(gè)熒光團(tuán)對(duì)ER進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，基于FRET測(cè)量ERα-LBD二聚體的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，并將該方法用于評(píng)估ER配體的激動(dòng)劑和拮抗劑活性。Schaufele等[69]利用FRET研究了分別用CFP和YFP標(biāo)記的AR二聚體的形成，發(fā)現(xiàn)AR的二聚化只發(fā)生在小分子配體結(jié)合后，并主要在細(xì)胞核內(nèi)。Nadal等[35]利用FRET測(cè)試了配體對(duì)于誘導(dǎo)AR二聚化的影響，發(fā)現(xiàn)激動(dòng)物質(zhì)能夠誘導(dǎo)AR二聚化，拮抗物質(zhì)則不能。Yoshimura等[70]將磷酸化突變體RXRα(YFP-T82D/S260D-RXRα)與CFP-RARβ共轉(zhuǎn)染于HEK293T細(xì)胞，在細(xì)胞核中檢測(cè)到的FRET信號(hào)非常低，而未磷酸化的RXRα(YFP-T82A/S260A-RXRα)與CFP-RARβ轉(zhuǎn)染后的FRET效率與野生型RXRα相當(dāng)，表明磷酸化的RXRα喪失了與RXRβ異源二聚化的能力。

FRET具有高靈敏性和特異性，能夠提供NR相互作用的位置信息，并且能夠和顯微鏡、色譜技術(shù)等多種儀器和技術(shù)結(jié)合使用[71〗。但是FRET需要一對(duì)FP分別作為供體蛋白和受體蛋白，目前可用于FRET的供-受體對(duì)存在光漂白的缺陷，即供體的發(fā)射光譜和受體吸收光譜有明顯的重疊[72-73]。

3.2 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)

與FRET不同，BRET利用生物發(fā)光酶如海腎螢光素酶(renilla reniformis luciferase, Rluc)作為供體分子，熒光蛋白作為受體分子，當(dāng)兩者之間距離<10 nm時(shí)，供體分子在底物如腔腸素(coelenterazine)的催化下發(fā)光并將能量轉(zhuǎn)移給受體[73](圖3(b))。

Mulero等[74]利用BRET技術(shù)檢測(cè)PPAR-RXR異源二聚體的形成。Powell和Xu[56]利用BRET技術(shù)證明植物雌激素可選擇性誘導(dǎo)ERα同源二聚體、ERβ同源二聚體和ERα-ERβ異源二聚體的產(chǎn)生，由于不同二聚體的功能差異顯著，使得該方法可用于ER二聚體選擇性的雌激素類物質(zhì)篩選。Grossmann等[75]利用BRET研究MR同源二聚過程，發(fā)現(xiàn)二聚化發(fā)生在熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)解離以及核轉(zhuǎn)移之后。Giner等[76]優(yōu)化了BRET方法，可直接測(cè)定核受體二聚體對(duì)COA的募集，通過比較了維甲酸類物質(zhì)(rexinoids)誘導(dǎo)的RXR-RXR同源二聚體、Nur77-RXR異源二聚體和Nurr1-RXR異源二聚體對(duì)COA的募集發(fā)現(xiàn)不同的同源和異源二聚體顯示出對(duì)COA的差異性募集活性。Cotnoir-White等[77]在BRET的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種在活細(xì)胞中檢測(cè)三元復(fù)合物的方法，即生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移與熒光增強(qiáng)的聯(lián)合轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer with fluorescence enhancement by combined transfer, BRETFect)，并用該方檢測(cè)E2、OHT等配體誘導(dǎo)的ERα-ERα同源二聚體與ERα-ERβ異源二聚體對(duì)COA的募集。

BRET不需要激發(fā)源，利用化學(xué)供體底物，背景熒光值可忽略不計(jì)，避免了FRET可能產(chǎn)生的光漂白問題，減少假陰性結(jié)果[56]。但BRET需要特定設(shè)備，且熒光素及底物價(jià)格昂貴，無(wú)法對(duì)比較弱的核受體間蛋白相互作用進(jìn)行檢測(cè)[73,78]。

3.3 雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)

BiFC是最通用的蛋白質(zhì)互補(bǔ)分析(protein-fragment complementation assays, PCA)技術(shù)，其原理是將FP切開形成不發(fā)熒光的2個(gè)片段(N末端和C末端)，這2個(gè)片段分別與目標(biāo)蛋白融合，如果目標(biāo)蛋白相互作用，則2個(gè)互補(bǔ)片段彼此靠得足夠近可恢復(fù)它們的熒光活性[78](圖3(c))。

圖3 FRET(a)、BRET(b)和BiFC(c)原理圖注：FRET中當(dāng)熒光供體蛋白和熒光受體蛋白間距離<10 nm時(shí)，供體將能量轉(zhuǎn)移給受體；BRET利用生物發(fā)光酶作為供體分子， 熒光蛋白作為受體分子，當(dāng)兩者之間距離<10 nm時(shí)，供體將能量轉(zhuǎn)移給受體；BiFC將熒光蛋白切開形成不發(fā)熒光的2個(gè)片段 (N末端和C末端)，并分別與目標(biāo)蛋白融合，如果目標(biāo)蛋白相互作用，則會(huì)恢復(fù)熒光活性。Fig. 3 Schematic diagram of FRET (a), BRET (b) and BiFC (c)Note: FRET indicates that when the distance between the fluorescent donor protein and the fluorescent receptor protein is less than 10 nm, the donor transfers energy to the receptor; BRET uses bioluminescent enzymes as donor and fluorescent protein as receptor; when the distance between them is less than 10 nm, the donor transfers energy to the receptor; BiFC cleaves the fluorescent protein into two fragments (N-terminal and C-terminal) that do not fluoresce, which are fused with the target protein respectively; if the target protein interacts, the fluorescence activity will be restored.

利用BiFC將全長(zhǎng)的ERα分別融合到Y(jié)FP突變體(citrine-YFP)的N末端和C末端并共轉(zhuǎn)染于COS-7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ERα激動(dòng)劑E2、BPA、染料木黃酮和對(duì)羥基苯甲酸丁酯(butylparabene)，拮抗劑氟維司群(ICI)以及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑4-羥基他莫昔芬(4-OHT)都能劑量依賴性地增加ERα-ERα同源二聚體熒光信號(hào)；有趣的是，ICI和4-OHT誘導(dǎo)的熒光信號(hào)高于E2，這可能是由于配體誘導(dǎo)的二聚體或構(gòu)象差異所致[79]。雄激素受體剪接變異體(AR splice variants, AR-Vs)的表達(dá)上升被認(rèn)為是產(chǎn)生以AR為靶點(diǎn)的藥物抗藥性的重要機(jī)制，Xu等[80]使用BiFC研究了2個(gè)主要的AR-Vs，發(fā)現(xiàn)它們不僅彼此間發(fā)生同源和異源二聚化，而且還與全長(zhǎng)雄激素受體異源二聚化，闡明了AR-V介導(dǎo)基因調(diào)控的機(jī)制，并為合理的藥物設(shè)計(jì)提供了重要的途徑。Bedi[81]將LXRα貢獻(xiàn)二聚化界面的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變，使用BiFC表征LXRα突變體與RXRα和PPARα在活細(xì)胞中形成異源二聚體的能力，證明二聚化界面關(guān)鍵氨基酸突變能夠削弱二聚化效應(yīng)。

BiFC方法簡(jiǎn)單直觀，既可以檢測(cè)蛋白之間的相互作用，也可以定位相互作用蛋白質(zhì)的位點(diǎn)，避免了用外源試劑處理細(xì)胞可能產(chǎn)生的問題[82]。但其目標(biāo)蛋白容易受到FP片段的影響，當(dāng)2個(gè)目標(biāo)蛋白包含在單一復(fù)合物中但彼此沒有相互作用時(shí)易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[83]。

3.4 計(jì)算機(jī)模擬

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，分子動(dòng)力學(xué)模擬(molecular dynamics, MD)越來(lái)越多地被用來(lái)研究生物大分子作用[84]。但大多數(shù)MD模擬針對(duì)核受體單體進(jìn)行研究，主要涉及配受體結(jié)合過程和共因子招募過程[51, 85]，僅有少部分針對(duì)核受體二聚化過程進(jìn)行模擬研究。

Zhuang等[86]利用經(jīng)典的分子動(dòng)力學(xué)模擬(MD)和隨機(jī)加速分子動(dòng)力學(xué)(random acceleration molecular dynamics, RAMD)模擬分別研究甲狀腺激素T3與TRα-LBD、TRβ-LBD和TRα/LBD-RXR/LBD異源二聚體的解離效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)相比于TR單體，TR異源二聚體顯著影響T3的解離，這為研究其他TR配體提供了重要信息。Sonoda等[87]利用部分增強(qiáng)采樣分子動(dòng)力學(xué)模擬(locally enhanced sampling molecular dynamics simulations)分別研究E2和雌激素受體調(diào)節(jié)劑雷洛昔芬(raloxifene, RAL)與ERα-LBD單體和ERα/LBD-ERα/LBD同源二聚體間的解離機(jī)制，發(fā)現(xiàn)相比于ER單體，其二聚化強(qiáng)烈抑制E2并改變RAL的解離路徑。模擬研究中配體的解離路徑的差異表明二聚化對(duì)于配體調(diào)節(jié)具有重要作用。Chakraborty等[88]利用分子動(dòng)力學(xué)模擬證明ERα-ERα同源二聚體比ERα-ERβ異源二聚體更穩(wěn)定。此外，F(xiàn)ratev等[89]利用加速分子動(dòng)力學(xué)(accelerated molecular dynamics, aMD)模擬研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌干擾物配體可以通過二聚體間的相互作用控制H12的位置，這對(duì)于核受體的激活至關(guān)重要。計(jì)算機(jī)模擬方法因其快速且省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，已成為輔助內(nèi)分泌干擾物質(zhì)干擾核受體研究的重要手段之一。

4 總結(jié)與展望(Conclusions and prospect)

天然激素調(diào)控的核受體作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，幾乎參與了人體所有組織和器官的功能調(diào)節(jié)。作為環(huán)境化合物的重要干擾靶點(diǎn)，當(dāng)EDCs作用于核受體后，會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，最終產(chǎn)生不良結(jié)局。EDCs主要通過模仿或拮抗天然激素，與核受體結(jié)合并影響核受體的二聚化過程，核受體通過同源或異源二聚后形成多聚體，進(jìn)一步結(jié)合到DNA反應(yīng)原件，通過共調(diào)節(jié)因子的招募過程最終調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性。在以往研究中，人們主要著眼于受體-配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、共調(diào)節(jié)因子招募以及核受體-DNA結(jié)合過程，但卻無(wú)法完美解釋許多內(nèi)分泌干擾過程。近幾年，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，核受體二聚化過程也對(duì)EDCs的內(nèi)分泌干擾活性存在決定性的作用。因此，本文就EDCs介導(dǎo)的核受體二聚化轉(zhuǎn)錄機(jī)制、核受體二聚化與轉(zhuǎn)錄活性間的關(guān)系以及基于活細(xì)胞的核受體二聚化研究方法進(jìn)行了概述，以期為深入理解內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的分子機(jī)制，推進(jìn)化合物內(nèi)分泌干擾風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

核受體二聚化過程對(duì)于研究化合物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)至關(guān)重要，已有進(jìn)展主要針對(duì)EDCs對(duì)ER二聚化的影響，而關(guān)于EDCs與其他核受體二聚化過程的研究較少，探究EDCs對(duì)核受體二聚化的影響道阻且長(zhǎng)。核受體二聚化機(jī)制復(fù)雜，環(huán)境領(lǐng)域研究核受體二聚化的過程極其依賴于生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，但目前生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)Χ刍貏e是異源二聚化的作用機(jī)制和生物學(xué)功能尚不明確。解析核受體二聚化機(jī)制涉及很多生命科學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，這對(duì)環(huán)境領(lǐng)域的研究人員而言困難重重，今后在探究EDCs對(duì)核受體二聚化影響機(jī)制的過程中需加強(qiáng)與生命科學(xué)的合作。

然而面對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的未知內(nèi)分泌干擾活性的環(huán)境污染物，生化實(shí)驗(yàn)已經(jīng)無(wú)法對(duì)其內(nèi)分泌干擾活性逐一檢測(cè)，且利用生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行二聚化測(cè)定費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)財(cái)。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，分子動(dòng)力學(xué)模擬、分子對(duì)接等相關(guān)技術(shù)越來(lái)越多地被應(yīng)用于生物大分子作用的研究中。已有很多計(jì)算機(jī)輔助的相關(guān)技術(shù)被用于研究配受體結(jié)合和共因子招募過程，但有關(guān)內(nèi)分泌干擾物對(duì)核受體二聚化影響的計(jì)算機(jī)模擬研究相對(duì)較少。今后可更多的將計(jì)算機(jī)技術(shù)應(yīng)用于核受體二聚化過程的研究，并結(jié)合配受體結(jié)合和共因子招募過程，開發(fā)基于分子啟動(dòng)事件的核受體內(nèi)分泌干擾篩查模型，為綠色化學(xué)的開發(fā)夯實(shí)基礎(chǔ)。