俞燕芳 黃金枝 林羨 王亞威王豐 彭曉虹 杜賢明 王軍文

(1.江西省蠶桑茶葉研究所 330202；2.江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所 330202；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 510610)

近年來，鑒于化肥過量施用的諸多弊端，全國各地積極開展化肥減施增效技術(shù)的研究與應(yīng)用推廣。微生物菌劑因?yàn)樵诟牧纪寥?、促進(jìn)植物生長和提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量等多方面作用顯著正日益受到重視[1～2]。目前商品微生物菌劑主要有發(fā)酵類菌劑和功能類菌劑。功能類菌劑由具有解磷、解鉀、固氮、拮抗病害等功能的菌株組成。近年來，微生物菌劑已在多種蔬菜、果樹和中藥材等作物上開展了試驗(yàn)研究并取得了良好的效果[3～6]。

桑樹是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，桑葉中富含蛋白質(zhì)、碳水化合物和維生素等營養(yǎng)成分，同時(shí)還含有多酚和生物堿等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、抗癌和抑菌等保健功效，是一種藥食兩用的植物資源[7～8]。研究表明，不同的施肥條件會(huì)影響桑樹的生理代謝及活性成分的積累[9～10]。傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)栽桑的目的是獲取桑葉養(yǎng)蠶，桑樹栽培依賴化肥的現(xiàn)象較普遍，導(dǎo)致土壤肥力下降，肥料利用率降低，桑葉品質(zhì)下降。目前關(guān)于微生物菌劑對(duì)桑樹生長及品質(zhì)影響研究甚少。

本研究在適量減施化肥條件下，通過田間試驗(yàn)，探究不同微生物菌劑對(duì)桑葉產(chǎn)量及其活性成分的影響，以期為微生物菌劑在桑樹栽培上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑樹品種為金十，8年生低干桑?？莶菅挎邨U菌(200億/g)、綠色木霉菌(50億/g)、解淀粉芽孢桿菌(200億/g)和膠質(zhì)芽孢桿菌(200億/g)購自河南省沃寶生物科技有限公司。復(fù)合肥(N∶P2O5∶K2O，17∶17∶17)購自新洋豐農(nóng)業(yè)科技股份有限公司。有機(jī)肥(總養(yǎng)分11.24%，有機(jī)質(zhì)84.9%，N為3.36%，P2O5為4.55%，K2O為3.33%)購自福建省綠屯生物科技有限公司。

沒食子酸、蘆丁、1-脫氧野尻霉素(DNJ)標(biāo)準(zhǔn)品和芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚試劑、乙腈(色譜級(jí))、甲醇(色譜級(jí))和乙酸(色譜級(jí))購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SK3310HP超聲清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；FW135高速粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 施肥處理

試驗(yàn)于2020年2—10月在江西省南昌市南昌縣黃馬鄉(xiāng)江西省蠶桑茶葉研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)含量為28.2g/kg，全氮1.92g/kg，有效磷6.46mg/kg，速效鉀160.59mg/kg。

選擇樹形、樹勢(shì)相近的桑樹，參考微生物肥料田間試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程及肥效評(píng)價(jià)指南(NY/T1536—2007)，試驗(yàn)共設(shè)置7個(gè)處理，分別定義為處理1(CK0，未施肥)、處理2(CK1，常規(guī)施肥)、處理 3(CK2，減量施肥)、處理4(J1，CK2+枯草芽孢桿菌)、處理5(J2，CK2+綠色木霉菌)、處理6(J3，CK2+解淀粉芽孢桿菌)、處理7(J4，CK2+膠質(zhì)芽孢桿菌)。4月15日和5月27日施肥，穴施。常規(guī)施肥為800kg/hm2復(fù)合肥。減量施肥為400kg/hm2復(fù)合肥和400kg/hm2有機(jī)肥。微生物菌劑施用量為有機(jī)肥重量的1%。每個(gè)處理 3 個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)選擇4株作調(diào)查。

1.3.2 桑葉產(chǎn)量測(cè)定

施肥后，每個(gè)處理隨機(jī)選擇12株桑樹，分別在4月20日、5月27日、7月18日和9月7日進(jìn)行桑葉產(chǎn)量調(diào)查，4次產(chǎn)量的總和為全年桑葉產(chǎn)量。

1.3.3 桑葉多酚和DNJ含量測(cè)定

在每次調(diào)查產(chǎn)量時(shí)，每個(gè)處理分別隨機(jī)采集相同葉位的嫩桑葉200g左右，60℃烘干后測(cè)定總酚和DNJ含量。 DNJ提取及含量測(cè)定方法如下[11]：稱取0.1g桑葉粉在10mL離心管中，加 0.05mol/L 鹽酸 3mL，渦旋1min后超聲30min，10 000rpm 離心10min，取上清液。重復(fù)以上步驟提取一次，合并2次上清液，用 0.05mol/L 鹽酸定容至10mL。在5.0mL離心管中加入100μL提取液(或不同濃度DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液)和100μL硼酸鉀緩沖液(0.4mol/L， pH值8.5)，再加入200μL的 FMOC-Cl溶液 (5mmol/L)，混勻后 25℃水浴反應(yīng) 20min，加入100μL甘氨酸(1mol/L)終止反應(yīng)，再加入100μL醋酸水(1%)及400μL超純水，以0.45μm 微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定DNJ含量。液相色譜條件為：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm× 250mm，5μm)，進(jìn)樣量10μL，流動(dòng)相為乙腈：0.1% 醋酸(1∶1，v/v)，流速 0.5mL/min，柱溫25℃，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長254nm，發(fā)射波長322nm。以峰面積和對(duì)應(yīng) DNJ 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為坐標(biāo)繪制 DNJ 標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算每個(gè)樣品的 DNJ 含量。

桑葉多酚提取及含量測(cè)定方法如下：稱取干燥桑葉粉 0.5g，加入80%乙醇15mL，超聲提取30min，10 000r/min 離心15min，取上清液。重復(fù)以上步驟提取2次，合并3次上清液，用 80% 甲醇定容至50mL，作為酚類物質(zhì)提取液待測(cè)?？偡雍繙y(cè)定方法如下[12]：以沒食子酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，樣品測(cè)定結(jié)果表示為mg沒食子酸當(dāng)量/g 干重(mgGAE/g DW)。將25μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加入到96孔酶標(biāo)板中，再加入125μL福林-酚試劑(0.2N)，室溫下反應(yīng)10min后加入125μL的飽和Na2CO3溶液，在振蕩器上緩慢搖勻后室溫放置 30min，然后在 765nm下測(cè)定吸光度。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因ANOVA進(jìn)行平均值比較，利用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析，用OriginPri8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微生物菌劑對(duì)桑葉產(chǎn)量的影響

如圖1所示，CK0處理(未施肥)的桑葉產(chǎn)量最低，J3處理(CK2+解淀粉芽孢桿菌)的產(chǎn)量最高。與CK1處理(常規(guī)施肥)相比，CK2(減量施肥)的桑葉產(chǎn)量下降了0.1kg/株。J1(CK2+枯草芽孢桿菌)、J2(CK2+綠色木霉菌)、J3(CK2+解淀粉芽孢桿菌)和J4(CK2+膠質(zhì)芽孢桿菌)的桑葉產(chǎn)量均高于CK2。但是，各處理組的桑葉產(chǎn)量無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 不同微生物菌劑處理桑葉產(chǎn)量比較

2.2 不同微生物菌劑對(duì)桑葉多酚含量的影響

如圖2所示，在試驗(yàn)期內(nèi)不同處理組桑葉的多酚含量總體均呈下降趨勢(shì)。在5月27日，CK2處理桑葉多酚含量顯著高于CK1，J2處理和J4處理桑葉多酚含量與CK2沒有顯著性差異(P>0.05)，J1和J3多酚含量顯著低于CK2(P<0.05)。在7月18日，J3多酚含量顯著低于其他處理組(P<0.05)。在9月7日，與CK2相比，J4多酚含量顯著增加，而J2和J3多酚含量顯著降低(P<0.05)。

圖2 不同微生物菌劑處理桑葉多酚含量比較

由此可見，在不同的生長時(shí)期，微生物菌劑對(duì)桑葉多酚的含量存在不同程度的影響。在減量化肥的基礎(chǔ)上，施用膠質(zhì)芽孢桿菌劑(J4)能夠增加桑葉多酚含量，而施用解淀粉芽孢桿菌劑(J3)會(huì)降低桑葉多酚含量。

2.3 不同微生物菌劑對(duì)桑葉DNJ含量的影響

如圖3所示，在試驗(yàn)期內(nèi)桑葉中的DNJ含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在7月18日采摘的桑葉DNJ含量最高。在7月18日和9月7日，CK2桑葉的DNJ含量顯著高于CK0和CK1，與CK2相比，J1顯著增加桑葉DNJ含量(P<0.05)。在7月18日，與CK2相比，J3顯著降低桑葉DNJ含量(P<0.05)。在9月7日，與CK2相比，J4顯著降低桑葉DNJ含量(P<0.05)。J2和CK2在5月27日差異不顯著，但在7月18日開始差異顯著(P<0.05)。由此可見，減量施肥可以增加桑葉DNJ含量，不同微生物菌劑會(huì)影響桑葉DNJ的合成與積累，施用枯草芽孢桿菌劑(J1)和綠色木霉菌劑(J2)能夠增加桑葉DNJ含量，而施用解淀粉芽孢桿菌(J3)和膠質(zhì)芽孢桿菌劑(J4)會(huì)降低桑葉DNJ含量。

圖3 不同微生物菌劑處理桑葉DNJ含量比較

3 討論與結(jié)論

施肥是提高桑葉產(chǎn)量和改善桑葉品質(zhì)的主要手段。有研究表明，在減量化肥基礎(chǔ)上增施有機(jī)肥和微量元素能夠改善土壤理化性狀，提高桑樹光合性能，提高果桑產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，增施微生物菌劑，可以提高桑葉產(chǎn)量，但影響不顯著，這可能與微生物菌劑施用的濃度以及大田環(huán)境復(fù)雜性有關(guān)。杜紅[13]研究表明，中等濃度膠質(zhì)芽孢桿菌(0.10g菌劑/kg土)顯著提高油菜產(chǎn)量，高濃度(1.00g菌劑/kg土)會(huì)抑制油菜的生長[13]。

多酚和DNJ是桑葉中的重要活性成分，是桑葉發(fā)揮降血糖、降血脂和抗菌消炎等功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[14～15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，施用微生物菌劑顯著影響桑葉中的多酚和DNJ含量。其中，施用膠質(zhì)芽孢桿菌劑(J4)能夠增加桑葉多酚含量，而降低桑葉DNJ含量；施用解淀粉芽孢桿菌劑(J3)會(huì)降低桑葉多酚和DNJ含量；施用枯草芽孢桿菌劑(J1)和綠色木霉菌劑(J2)能夠增加桑葉DNJ含量。這可能與微生物菌劑影響光合作用從而影響植物的代謝活動(dòng)有關(guān)。汪晶晶等[16]研究發(fā)現(xiàn)，海洋解淀粉芽孢桿菌GM-1菌劑處理水稻，水稻葉片中總酚和黃酮含量明顯提高。王愛斌等[17]研究表明，酵素菌肥、EM菌堆肥、木霉菌制劑、枯草芽孢桿菌制劑和阿維菌素有機(jī)肥，都能促進(jìn)藍(lán)莓葉片氮、磷、鉀、葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖和總酚的積累。葉如夢(mèng)等[18]比較了在不同土壤養(yǎng)分(貧瘠組、營養(yǎng)組)條件下，灌根接種內(nèi)生枯草芽孢桿菌B117對(duì)香蜂花生長生理及總酚、總黃酮、迷迭香酸含量的影響，結(jié)果表明在營養(yǎng)組中接菌能顯著降低營養(yǎng)組總酚和迷迭香酸含量，而在貧瘠土壤中接菌效果并不顯著?？梢?，微生物菌劑對(duì)植物次生代謝物的影響因植物種類、栽培環(huán)境等條件不同而不同。

綜上，在減量施肥基礎(chǔ)上施用一定劑量的枯草芽孢桿菌劑(J1)或綠色木霉菌劑(J2)，能夠促進(jìn)桑葉DNJ的合成與積累，而施用膠質(zhì)芽孢桿菌劑(J4)，可促進(jìn)桑葉多酚的積累，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。