孫 杰，吳章橋，何昌杰，葉媛麗，卓 蕾

（1 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院/四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川綿陽(yáng) 621010）

1 分子標(biāo)記技術(shù)用于重樓鑒定的研究進(jìn)展

目前，市場(chǎng)上正品重樓藥材的混偽品較多，但由于其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，且不同種植物的根莖形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)較為相似，利用傳統(tǒng)方法難以對(duì)其進(jìn)行鑒定。而分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記技術(shù)，具有信息量大、重復(fù)性好、不易受外界環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)已用于重樓鑒定的分子標(biāo)記技術(shù)有DNA 條形碼、SSR 分子標(biāo)記、CDDP 分子標(biāo)記、SCoT 分子標(biāo)記等技術(shù)及HPLC 指紋圖譜，其中DNA 條形碼技術(shù)的應(yīng)用較為廣泛。

1.1 基于DNA 條形碼技術(shù)

姜黎等[2]采用DNA 條形碼方法對(duì)36 份正品重樓及常見(jiàn)混偽品進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)將ITS 全序列用作DNA 序列能快速區(qū)分其正偽，可用于重樓藥材的鑒定。劉濤等[3]研究得出，35 份滇重樓樣品的psbA-trnH序列用作DNA 序列，可作為一種鑒定滇重樓藥材的新方法，且具有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。次年，方海蘭等[4]首次將DNA 條形碼技術(shù)用于重樓藥材種子種苗的鑒定，結(jié)果表明，ITS 序列可有效鑒別正品重樓及其混偽品的種子種苗，能從源頭上保證重樓藥材種子種苗的真實(shí)性。研究結(jié)果再次證明了ITS 序列能有效鑒定不同重樓藥材。劉立敏等[5]利用DNA 條形碼技術(shù)結(jié)合HPLC 含量測(cè)定，有效區(qū)分了重樓屬10 種藥用植物，說(shuō)明ITS2 序列可用于重樓藥材的鑒定。同年，葉方等[6]對(duì)武當(dāng)山重樓屬植物進(jìn)行種內(nèi)分子的鑒定研究，也得出與之一致的結(jié)論，ITS2 序列作為DNA 條形碼序列，可以將不同品種的重樓植物很好地區(qū)分開(kāi)。并且，試驗(yàn)結(jié)果不支持寬葉重樓、狹葉重樓成為獨(dú)立的變種，建議將其作為七葉一枝花的變形處理。次年，過(guò)立農(nóng)等[7]將ITS 序列和ITS2 序列相結(jié)合，有效地將60 批栽培重樓樣品鑒別到種，確定了樣品中的10 個(gè)品種。劉杰等[8]利用DNA 條形碼技術(shù)，確定重樓藥材疑似偽品并非中國(guó)藥典收錄品種，并推斷其基原為吉林延齡草，再一次證明了ITS2 序列和NJ 聚類樹(shù)可有效鑒定重樓藥材。

1.2 基于其他分子標(biāo)記技術(shù)

袁會(huì)瓊等[9]對(duì)云南重樓和長(zhǎng)柱重樓共20 批重樓樣品建立HPLC 指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)兩者圖譜相似度分別為0.905～0.998 和0.905～0.986，均可作為該重樓藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。聚類分析和主成分分析結(jié)果均將兩者明顯區(qū)分，表明HPLC 指紋圖譜可有效作用于重樓植物的品種鑒定且準(zhǔn)確度較高，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，相比于云南重樓，長(zhǎng)柱重樓有效成分中重樓皂苷Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ含量更高。王海明等[10]基于RNA-seq 技術(shù)對(duì)14 份梵凈山重樓塊根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，開(kāi)發(fā)出16 對(duì)可有效區(qū)分14 份梵凈山重樓種質(zhì)的SSR 引物，并且基于SSR標(biāo)記的聚類圖將14 個(gè)重樓種質(zhì)聚類在2 個(gè)類群。周武先等[11]基于CDDP 分子標(biāo)記完成了對(duì)13 份不同重樓品種的鑒定，并根據(jù)CODE128 條形碼編碼規(guī)則為該13 份重樓屬藥用植物構(gòu)建了指紋圖譜和條形碼分子身份證，為快速鑒定重樓屬植物提供了便利。程虎印等[12]基于SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，陜西產(chǎn)重樓屬中6個(gè)類群植物的SCoT 在種間和種內(nèi)存在差異，表明SCoT 分子標(biāo)記可用于重樓屬植物的鑒定。

通過(guò)這些分子標(biāo)記技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，不僅為重樓藥材的鑒別提供了新的、準(zhǔn)確有效的方法，還可以進(jìn)一步防止市場(chǎng)上出現(xiàn)混偽品的現(xiàn)象，不斷規(guī)范重樓藥材的市場(chǎng)環(huán)境。

2 分子標(biāo)記技術(shù)用于重樓遺傳多樣性的研究進(jìn)展

種質(zhì)資源研究是對(duì)藥用植物遺傳育種、資源保護(hù)及利用的重要前提，而遺傳多樣性研究是對(duì)其進(jìn)行種質(zhì)資源研究的重要內(nèi)容，分子標(biāo)記技術(shù)因其具有良好的適用性，在重樓藥材遺傳多樣性研究中的應(yīng)用也越來(lái)越普遍。

張曉瑞等[13]對(duì)4 個(gè)產(chǎn)地的17 份重樓樣品進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITS2 序列的遺傳位點(diǎn)和聚類進(jìn)化與重樓品種有關(guān)，并且不同地域環(huán)境對(duì)其遺傳序列有重要影響。次年，周武先等[11]利用CDDP 分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)13份重樓屬種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。程虎印等[10]采用SCoT 分子標(biāo)記及UPGMA 分析得出6 種重樓屬植物在物種水平上具有較高的遺傳多樣性，并對(duì)其進(jìn)行了排序，由高到低依次為七葉一枝花、寬葉重樓、具柄重樓、狹葉重樓、寬瓣重樓和北重樓。同時(shí)，結(jié)果表明，七葉一枝花與北重樓為不同種群，支持將寬瓣重樓、寬葉重樓等劃分變種的觀點(diǎn)分類體系。Zhao 等[14]采用SCoT結(jié)合SRAP 的分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，達(dá)比山脈的33 個(gè)重樓植物遺傳基礎(chǔ)較窄，其種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，并且發(fā)現(xiàn)SCoT 分子標(biāo)記具有更高的標(biāo)記效率和更高的多態(tài)性檢測(cè)能力。Hoang 等[15]采用RAPD 技術(shù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，來(lái)自4 個(gè)生態(tài)區(qū)域的55 份重樓樣本間遺傳多樣性有明顯差異，且不同區(qū)域之間重樓遺傳多樣性水平較高（Gst=0.301）。Wang 等[16]研究確定的EST-SSR 標(biāo)記可以作為重樓育種的標(biāo)記之一，結(jié)果揭示了重樓種質(zhì)資源適度的遺傳多樣性（He=0.527）和低遺傳分化（Fst=0.103）。陳中蘇直等[17]采用SSR 分子標(biāo)記分析得出，云南省內(nèi)5 個(gè)不同居群共115 份滇重樓樣品具有較高的遺傳多樣性，且遺傳變異主要發(fā)生在各居群內(nèi)。吳喆等[18]采用FTIR 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法分析云南重樓及其近緣種的親緣關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLS-DA 分類效果更好，能將5 種野生重樓屬植物準(zhǔn)確區(qū)分，同時(shí)，云南重樓與南重樓和百花重樓之間的親緣關(guān)系較近，而與毛重樓和五指蓮的關(guān)系較遠(yuǎn)。Huang 等[19]基于AFLP 標(biāo)記對(duì)15 個(gè)野生種群和17 個(gè)栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究表明，在物種水平上，栽培品種遺傳多樣性高于野生種群，但大多數(shù)基因變異存在于各自種群中，并且貴州野生種群比云南種群表現(xiàn)出更豐富的遺傳多樣性。尹曉蛟等[20]對(duì)從13 份重樓屬植物中選取的18 個(gè)表型性狀進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重樓樣品的16 個(gè)性狀在各種質(zhì)間達(dá)到顯著或極顯著差異水平；遺傳多樣性指數(shù)達(dá)1.88～2.66，類型豐富；經(jīng)主成分分析發(fā)現(xiàn)，累計(jì)百分比高于85%的5 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.918%，對(duì)重樓表型差異影響大；同時(shí)，性狀相關(guān)性研究表明，對(duì)重樓產(chǎn)量起到?jīng)Q定性作用的根莖的長(zhǎng)度、最大直徑及其干質(zhì)量均具有較高的多樣性，這對(duì)在今后的育種工作中利用現(xiàn)有種質(zhì)資源來(lái)提高重樓藥材的產(chǎn)量潛力具有重要指導(dǎo)意義。

3 重樓基因組及轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究進(jìn)展

基因組是一個(gè)物種所有遺傳信息的總和。轉(zhuǎn)錄組廣義上是指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合；狹義上是指所有mRNA 的集合。Liu 等[21]利用RNA-seq 技術(shù)分別對(duì)8 年生重樓和4 年生重樓的根的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，從其根細(xì)胞獲得大約87577 個(gè)unigene，通過(guò)序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)了重樓植物產(chǎn)生類固醇的代謝途徑，得出25 個(gè)單基因負(fù)責(zé)重樓植物體內(nèi)皂素類固醇物質(zhì)的合成的結(jié)論，為瀕危植物重樓基因組的研究提供了寶貴數(shù)據(jù)。Wang 等[16]對(duì)重樓屬植物進(jìn)行Illumina HiSeq 2000 第二代高通量測(cè)序，從其根細(xì)胞共獲得56095 條unigene，平均長(zhǎng)度為202bp，其中49.7%的unigene 獲得注釋信息。結(jié)果表明，這些unigene 主要映射到重樓體內(nèi)的碳水化合物代謝、能量代謝和二次代謝物生物合成途徑，為今后對(duì)重樓根質(zhì)繼代謝物合成和種群遺傳學(xué)的分子機(jī)制的研究提供了重要線索。Li 等[22]采用高通量測(cè)序分析法發(fā)現(xiàn)，從滇重樓種子及種皮中得到的1174 個(gè)miRNA 以直接或間接的調(diào)控模式參與滇重樓休眠種子的細(xì)胞、代謝及遺傳信息的處理過(guò)程，這對(duì)進(jìn)一步研究重樓屬植物變種的種子休眠分子機(jī)制有重要意義。Guan 等[23]從重樓屬植物指定的PpSMT1-1 和PpSMT1-2 中分別獲得了SMT1 基因的全長(zhǎng)序列，研究結(jié)果表明，PpSMT1-1 能催化環(huán)烯醇的轉(zhuǎn)化，而PpSMT1-2 缺乏這種催化活性，SMT 2 種不同的組織表達(dá)模式揭示了在不同發(fā)育階段重樓屬植物的不同器官中存在的表達(dá)差異，并且發(fā)現(xiàn)類固醇化合物是重樓屬植物中主要的活性物質(zhì)，這為進(jìn)一步開(kāi)展重樓植物中類固醇化合物的生物合成途徑的詳細(xì)研究建立了基礎(chǔ)。

4 總結(jié)與展望

重樓藥材藥用價(jià)值高，供不應(yīng)求，但重樓藥材混偽品充斥市場(chǎng)的現(xiàn)象嚴(yán)重，市場(chǎng)秩序較為混亂。研究發(fā)現(xiàn)，人為因素是造成滇重樓資源緊缺的直接原因之一[7]，應(yīng)制止過(guò)度的采挖行為，同時(shí)應(yīng)對(duì)生境較好的重樓居群加以保護(hù)，并通過(guò)不斷地規(guī)范市場(chǎng)監(jiān)督制度，保證重樓棲息地不被破壞和臨床用藥的安全。此外，分子標(biāo)記技術(shù)在重樓屬植物不同種質(zhì)間的鑒別與遺傳多樣性分析方面的應(yīng)用研究較為廣泛，這對(duì)于打擊市場(chǎng)上重樓藥材的濫用和冒用，以及進(jìn)一步研究分析與正品重樓親緣關(guān)系相近的重樓種屬，以擴(kuò)大重樓藥材的藥源具有重要指導(dǎo)意義。但是，目前對(duì)于重樓藥材的基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組學(xué)的研究相對(duì)較少，筆者認(rèn)為可以結(jié)合現(xiàn)有研究結(jié)果加大在這些方面的研究力度，深入研究，以期為重樓種質(zhì)育種和優(yōu)質(zhì)新品種的獲得給予進(jìn)一步指導(dǎo)。